定点突变提高枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的活力及稳定性

张显，龙水清，饶志明*，3，杨套伟，徐美娟

（1.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122；2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；3.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏无锡214122）

定点突变提高枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的活力及稳定性

张显1，2，龙水清1，2，饶志明*1，2，3，杨套伟1，2，徐美娟1，2

（1.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122；2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；3.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏无锡214122）

L-天冬酰胺酶可以催化L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸和氨。它可以通过降解食品原料中的L-天冬酰胺而降低高温烹制食品中丙烯酰胺的含量。由于食品预处理环境的复杂性，只有具有高酶活且稳定的酶才能满足食品生产中的应用。作者通过点突变提高来源于Bacillus subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶（BsAII）的酶活和热稳定性。通过序列比对和同源模拟选择5个点进行突变，构建6个突变菌株。酶活测定结果表明，突变体酶S299Nansz和P348Aansz的酶活较BsAII分别提高28%和32%。其中P348Aansz的热稳定性和pH稳定性较BsAII均有明显提高。本研究表明，第299和348位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。

L-天冬酰胺酶；定点突变；热稳定性；pH稳定性

L-天冬酰胺酶II（L-Asparaginase II，EC 3.5.1.1）可以催化L-天冬酰胺脱氨基转化成L-天冬氨酸和氨，该酶具有抗肿瘤活性，已被应用于治疗急性淋巴细胞白血病及霍金森病等。最新报道该酶也可用于减少高温制作食品中丙烯酰胺的生成。近年来，丙烯酰胺由于对人体潜在的致癌作用而引起人们的关注［1-2］。丙烯酰胺在高温烘烤及油炸食品中含量较高，它主要是由天冬酰胺和还原糖通过美拉德反应生成。美拉德反应是一种普遍的非酶褐变现象，是油炸及烘烤食品色味的主要形成途径［3］。研究表明，L-天冬酰胺酶通过将天冬酰胺转化成天冬氨酸，有效降低食品中丙烯酰胺的含量而影响其色味的形成［4-5］。

目前，由Aspergillus oryzae和Aspergillus niger所产的L-天冬酰胺酶由于其优良特性已被人们普遍接受，如在pH 6.0～7.0、60℃条件下有较高的酶活［6-7］。但是由于高温、强酸碱、高盐、溶剂毒性等复杂的食品预处理环境，只有高酶活、耐高温、耐酸碱的天冬酰胺酶才具有较高的应用价值。

作者所在实验室在前期研究工作中将来源于枯草芽孢杆菌中的L-天冬酰胺酶II（BsAII）基因通过表达质粒载体pMA5在Bacillus subtilis 168中实现过量表达，经发酵优化后在5 L发酵罐中酶活达到89.48 U/mL。Gilbert将来源于Erwinia chrysanthemi中的天冬酰胺酶基因在E.coli和Erwinia carotovora中实现重组表达酶活分别为49、20.2 U/mL［8-9］。Hatanaka等克隆来源于Streptomyces中的天冬酰胺酶基因并在E.coli中实现重组表达，酶活达到23.02 U/mL。因此与其它研究相比，作者所在实验室的重组菌所产L-天冬酰胺酶具有更高的酶活，并且枯草芽孢杆菌为GRAS菌株，已被广泛应用于食品发酵行业，其安全性已得到广泛认可［10］。但是与已经工业化的L-天冬酰胺酶相比，本研究得到的L-天冬酰胺酶II的酶活和热稳定性还有待提高。

蛋白质工程是用于克服天然酶在工业应用过程中缺陷的重要手段，通常改造蛋白质的策略主要包括定点突变、定向进化等［11］。II型L-天冬酰胺酶属于同源四聚体，相邻两个单体形成两个活性中心区域［12］。每个催化中心由一个单体的C端区域与相邻单体的N端区域形成［13］。虽然每个“二聚体”都有两个活性中心区域，但只有具有四聚体结构的酶才有酶活［14］。由此，我们推断在该蛋白三维结构中距离酶催化活性中心区域较近的氨基酸残基对酶的稳定性和酶活可能具有重要的影响。近年来，研究者已经对L-天冬酰胺酶的催化机理进行了深入的研究，通过分析不同来源的L-天冬酰胺酶的晶体结构并结合点突变研究明确了该酶的催化活性中心位点。例如来源于E.coli的天冬酰胺酶的活性位点分别为：T12、Y25、S58、T89、D90、K162［14-17］。通过序列比对发现，不同来源的L-天冬酰胺酶的活性位点高度保守。因此，我们决定采用定点突变手段改造L-天冬酰胺酶II来提高其酶活和热稳定性，以提高其工业应用价值。采用序列比对和同源模拟来选择突变位点，试验结果表明，突变体酶S299Nansz和P348Aansz的酶活和稳定性较原始酶都有所提高。

1　材料与方法

1.1材料

pMA5载体，大肠杆菌JM109、枯草芽孢杆菌Bacilus subtilis 168：作者所在实验室保存。B am HI、M lu I等限制性内切酶，T4 DNA连接酶等：购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒等：购自Generay公司；其余为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1定点突变和重组质粒的构建以实验室已构建的重组质粒pMA5-ansz为模板，设计两条相互有重叠部分的含突变点的引物，见表1，利用突变引物通过重叠延伸PCR引进突变点［18］。

表1　基因克隆及定点突变引物Table 1 Primers used for site-directed mutagenesis and gene cloning

将相应的重叠延伸PCR产物及大肠-枯草穿梭质粒pMA5用Bam HI、M lu I进行双酶切，连接产物转入感受态大肠杆菌JM109中，挑单克隆提质粒，并将质粒送往上海生工进行测序。经测序后，将正确突变质粒利用化学法转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168感受态细胞中进行表达［19］。

1.2.2L-天冬酰胺酶的表达和纯化将重组菌接种至含有50μg/mL Kan的LB培养基中，培养温度37℃，摇床转速为160 r/min，培养24 h，离心收集菌体，上清液作为胞外粗酶液，菌体破碎液为胞内粗酶液，粗酶液可以用于酶活测定、SDS-PAGE分析或者-20℃保藏。酶的纯化采用文献［20］所述方法。

1.2.3L-天冬酰胺酶酶活的测定L-天冬酰胺酶酶活测定采用奈斯勒试剂法［12］。酶促反应体系1 mL：400μL 50 mmol/L L-Asn、400μL 50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、100μL适当稀释酶液，在40℃水浴中反应15min，加入100μL 15 g/dL三氯乙酸终止反应，对照管在水浴反应之前加入100μL 15 g/dL三氯乙酸。反应终止后在20 000 r/min条件下离心10 min，取200μL上清液加入到4.8 mL去离子水中，加入200μL奈斯勒试剂，利用分光光度计测定450 nm下的吸光度。酶活单位：在酶反应条件下，单位时间内产生1μmol/L NH3所需的酶量为1个酶活单位。蛋白质浓度采用Bradford法测定［21］。

1.2.4最适温度及温度稳定性在pH 7.5条件下，将纯酶液添加到反应体系中，将反应体系分别置于20、30、35、40、50、60℃下反应15 min，反应结束后测定酶活，分析不同反应温度对重组L-天冬酰胺酶催化反应的影响，获得此酶的最适反应温度。将纯酶液分别放置在30、40、50、60℃水浴锅中，每隔一段时间取样，测定酶活，考察重组酶在不同温度下的稳定性。

1.2.5最适pH及pH稳定性将纯酶液分别加入到不同pH缓冲液中（pH 4.0～6.0，0.05 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；pH 6.0～7.0，0.05 mmol/L磷酸盐缓冲液；pH 7.0～9.0，0.05 mmol/L Tris-HCl缓冲液；pH 9.0～10.0，0.05 mmol/L甘氨酸-NaOH缓冲液）于40℃反应15 min，奈斯勒试剂测定酶活，考察不同pH缓冲液对重组L-天冬酰胺酶催化反应的影响，获得重组酶的最适反应pH。将纯酶液加入到pH 6.0～10.0的缓冲液中，在4℃下放置12 h，测剩余酶活，考察重组酶在不同pH下的稳定性。

1.2.6动力学参数测定配制不同浓度的L-Asn溶液，加入过量的纯酶液，反应体系置于最适条件下反应，通过奈斯勒试剂测定产物氨的增加量，通过Lineweaver-Burk作图法计算获得的Km和kcat值。

1.2.7三维结构模拟及分析将BsAII的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服务器得到其三维结构。利用ClustalW2软件进行序列比对。利用PYMOL软件分析氨基酸残基间氢键相互作用。

2　结果与讨论

2.1突变位点的选择

将BsAII的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服务器，以与其序列相似度达到59.75%的同源四聚体蛋白（PDB id：1jsr，分辨率为1.70Å）为模板得到其三维结构模型，见图1。Chou-Fasman根据各个氨基酸在一些已知结构的蛋白中的表现，按构象参数由大到小分组，总结出Gly和Pro是α-螺旋的强破坏者，而Ala是α-螺旋的强形成者［22］。Gly由于侧链太小，构象不稳定，而Pro由于其亚氨基少一个氢原子，无法形成氢键，也是α-螺旋的强破坏者。与Gly相比，Ala能够在折叠时包埋更大的极性区域，以及其更低的折叠熵，因而能够稳定α-螺旋；与Pro相比，Ala由于侧链较小，不会增加蛋白骨架的构象变化，从而稳定α-螺旋［23］。因此我们根据同源模拟结果选择位于α-螺旋区域且距离活性中心较近的Gly和Pro将其突变为Ala，分别构建突变菌株G177A、P178A、P348A。

近年来，许多研究者已经对L-天冬酰胺酶的催化机理进行了深入的研究，活性位点较为明确，因此我们选择几个活性较高的L-天冬酰胺酶的氨基酸序列与BsAII进行序列对比，结果见图2。图2黑色框中的氨基酸残基为活性中心位点，在BsAII中为T61、Y75、S108、T141、D142、K214、S299、D334。通过序列比对我们发现除了第299与334位外，其余活性中心位点在不同来源的L-天冬酰胺酶氨基酸序列中非常保守。鉴于其它三个来源的L-天冬酰胺酶活性较高，因此我们把BsAII的第299和334位氨基酸残基突变成相应的氨基酸残基，分别构建突变菌株：S299N、D334E、D334G。

图1　BsAII三维结构Fig.1　Stereo representation of the native enzyme BsAII

图2　不同来源L-天冬酰胺酶氨基酸序列比对结果Fig.2　Sequences alignment of L-asparaginases from different bacteria

2.2L-天冬酰胺酶的表达与纯化

将6个突变株表达纯化后，通过分析SDSPAGE电泳图谱发现，蛋白质目的条带均在38 000左右，与理论值相符，见图3。

图3　突变体蛋白质纯化结果Fig.3　Purification ofmutan t enzymes

2.3L-天冬酰胺酶最适温度及温度稳定性

在40℃、pH 7.5条件下测定6个突变体酶及原始酶酶活，结果表明S299Nansz（115.78 U/mg）、P348Aansz（119.39 U/mg）比酶活分别比原始酶（90.45 U/mg）提高28%和32%，而其余突变体酶比酶活均比原始酶有所降低。第299和334位氨基酸残基的改变并没有引起酶活的大幅度降低，这说明这两个位点可能不是酶催化所必须的，或者是突变后其它位点的氨基酸残基补偿了这两个位点的结构变化。因此，我们选择突变体酶S299Nansz和P348Aansz做进一步研究。如图4所示，突变体酶S299Nansz、P348Aansz和原始酶BsAII的最适温度均为40℃。在20～50℃之间酶活都在60%以上，到60℃时酶活急剧下降，说明高温已经开始破坏蛋白质结构，对酶促反应造成较大的影响。

为了比较这三个酶的温度稳定性，我们测定了它们在不同温度下的半衰期，结果见表2。从表2可以看出，在30～50℃之间突变体酶P348Aansz的温度稳定性较BsAII都有较大的提高，而60℃时，P348Aansz的稳定性较BsAII有所下降，而突变体酶S299Nansz的热稳定性较原始酶变化不大。这说明第348位氨基酸残基所在的α螺旋结构对酶的温度稳定性有重要作用。在低温时可以较好地维持蛋白质的三维结构，而在高温时三维结构受到急剧破坏。

图4　突变体酶的最适反应温度Fig.4　Optimal tem perature of the wild-type enzyme and its varian ts

表2　突变体酶在不同温度下的半衰时间Table 2 Half-lives of w ild-type enzyme and itsmutants for thermal inactivation

2.4L-天冬酰胺酶最适pH及pH稳定性

如图5所示，突变体酶S299Nansz的最适pH为7.5，而P348Aansz的最适pH为8.0。突变体酶S299Nansz与P348Aansz在pH 5～9之间都具有50%以上的酶活。

图5　突变体酶的最适pH值Fig.5 Optimal pH of the w ild-type enzym e and its variants

为了比较三个酶的pH稳定性，我们测定了三个酶在pH 6～10范围内放置12 h后的残余酶活，见图6。从图6可以看出，三个酶在pH 8～10范围内放置12 h后都保留70%以上的酶活，这表明该酶在偏碱性的条件下较稳定。突变体酶P348Aansz在pH 6～10范围内酶活均在70%以上，这说明突变后酶的耐酸碱能力也得到了较大的提高。

图6　突变体酶pH稳定性Fig.6 pH stability of thew ild-typeenzymeand itsvariants

2.5L-天冬酰胺酶的动力学参数

作者对突变体酶和原始酶的动力学参数进行了研究。如表3所示，突变体酶S299Nansz与P348Aansz的Km值均比原始酶有所提高，这表明突变后酶对底物的亲和力有所下降。而kcat/Km值均比原始酶高，这表明突变后酶促反应的催化效率有所提高，催化效率的提高可能是引起酶活提高的主要原因。

表3　突变体酶的动力学参数Tab le 3 K inetics of the w ild-type enzym e and its variants

2.6突变体酶的三维结构分析

酶活性中心及其附近区域的高柔性可能会表现出高的比酶活和低的活化能［24］。为了解释比酶活提高的原因，我们分析了点突变前后氢键的变化。从图7可以看出，突变前S299与周围氨基酸残基形成4个氢键，而突变后N299仅与周围氨基酸残基形成1个氢键。由于第299位氨基酸残基可能参与酶与底物的结合［18］，其与周围氨基酸残基氢键相互作用的减弱，可能造成酶与底物结合区域柔性的增大，从而增强酶对底物的捕捉或对产物的释放，这可能是引起酶活提高的主要原因。

第348位氨基酸氨基位于α-螺旋中，将P348突变为A348后，酶的热稳定性和pH稳定性都得到大幅度提高，这表明该位点对酶维持三维结构的稳定具有重要的作用。这一结果也与文献［22］相符。

图7　第299位氨基酸残基突变前后氢键变化Fig.7 Changes of hydrogen bond interactions between residue at 299 and other residues after mutation

3　结语

本研究通过定点突变提高了枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的活力及稳定性，提高了该酶的工业应用潜力。通过蛋白质结构模拟和分子间作用力分析，证明了L-天冬酰胺酶催化活性中心底物结合区域的柔性结构对酶活力有较大的促进作用，而位于α-螺旋上的脯氨酸（P348）对该酶的热稳定性有较大影响。本研究为其它来源的L-天冬酰胺酶的改造提供了相应的理论依据。

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Improving the Activity and Stability of L-Asparaginase from Bacillus subtilis by Site-Directed Mutagenesis

ZHANG Xian1，2，LONG Shuiqing1，2，RAO Zhiming*1，2，3，YANG Taowei1，2，XU Meijuan1，2
（1.Schoolof Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

L-Asparaginase catalyzes thehydrolysis of L-asparagine to L-aspartic acid and ammonia，which can hydrolyze free L-Asn to aspartic acid and decrease acrylam ide formation during food processingd.In order tomeet the high requirementsand complicated procedures of food processing，the activity and stability of L-Asparaginase need to beimproved.In this study，we successfully improved the enzymeactivity and stability of L-asparaginase（BsAII）from Bacillus subtilis B11-06by site-directedmutagenesis.Five residues of BsAIIwere selected and used to construct themutants by sequence alignmentand homologymodeling.The enzyme activity assayshowed that the enzyme activity of S299Nanszand P348Aaanszwere increased by 28%and 32%，respectively，as compared to the BsAII.The thermal stability and pH stability of P348Aanszwere significantly improved compared to thatof BsAII.This study showed that residues 299 and 348 in am ino acid sequence of BsAIIhad a great influence on the catalytic action，which provided a basis for the study of the catalytic mechanism of theenzyme，and extended theapplication in food industry.

L-asparaginase，site-directedmutagenesis，thermalstability，pH stability

Q789

A

1673—1689（2015）11—1128—07

2015-05-12

国家自然科学基金项目（31500065）；国家863计划项目（SS2015AA021004）；中国博士后科学基金资助项目（2015M570407）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（JUSRP11545）；工业生物技术教育部重点实验室开放课题（KLIB-KF201406）。

张显（1986—），男，江苏徐州人，工学博士，讲师，主要从事微生物代谢工程和生物催化开发方面的研究。

E-mail：zx@jiangnan.edu.cn

饶志明（1975—），男，江西临川人，农学博士，教授，博士研究生导师，主要从事应用微生物与代谢工程方面的研究。

E-mail：raozhm@jiangnan.edu.cn