浅谈L—天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究

王远锏 黄浩胜 陈震宇

【摘 要】来自于细菌和真菌等微生物的L-天冬酰胺酶通过切断癌细胞L-天冬酰胺的来源实现治疗癌症，本身存在如低毒性、致敏性等问题。使用的重组表达载体将具有无谷氨酰胺酶活性L-天冬酰胺酶提取并生产，扩大L-天冬酰胺酶表达能力并提高其工业化生产潜力。

【关键词】L-天冬酰胺酶；重组表达载体；

1 结构、性质、作用机理

癌细胞无法合成天冬酰胺而从周围细胞中获取。L-天冬氨酸酶降解L-天冬酰胺，切断癌细胞L-天冬酰胺来源抑制癌细胞生长。大肠杆菌中细胞质中表达L-天冬酰胺酶I组成型，具有低速水解L-天冬酰胺（L-Asn）与L-谷氨酰胺（L-Gln）的能力；在缺氧条件下，大肠杆菌周质空腔中积累形成包涵体，具有抗蛋白酶、对宿主毒性小、容易富集纯化等优点。L-天冬酰胺酶II为4亚基同聚体，该酶的四聚体形态具有活性，活性中心包括Lys、Cys、His三个氨基酸。细菌来源的L-天冬酰胺酶具有少量的谷氨酰胺酶活性，易产生过敏与超敏反应、血栓及出血等副作用，对肝脏毒害较大。

2 来源与生产

L-天冬酰胺酶在多种微生物体内均有表达，大肠杆菌是天冬酰胺酶药物最初来源，其L-天冬酰胺酶表达系统研究较为清楚。根据L-天冬酰胺酶II基因表达与ansB启动子有关[1]，受cAMP受体蛋白正调控与厌氧负调控。当胞内为低水平葡萄糖含量，cAMP含量升高，cAMP-cAMP受体蛋白复合物含量增加并结合ansB启动子中CAP结合位点，σ70RNA聚合酶与启动子结合强度提高，基因表达水平上升。除了大肠杆菌之外，真菌也是研究生产L-天冬酰胺酶的对象，Vijay[2]使用土曲霉MTCC1782作为培养对象生产L-天冬酰胺酶，产物产量与安全性都有提高。

3 L-天冬酰胺酶重组表达体系

在L-天冬酰胺酶的生产体系中主要包括大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、巴斯德毕赤酵母菌表达系统。低成本，高产量，生产周期短的大肠杆菌表达系统目前较为常用，梁毅偈等[3]完成了大肠杆菌Nissle1917L-天冬酰胺酶Ⅱ基因在大肠杆菌BL21中的表达，但产物无法正确折叠。枯草芽孢杆菌表达系统蛋白质分泌能力强，分泌蛋白纯化难度低。Feng Y等[4]将基因与含p43强启动子的表达载体pP43NMK重组并导入Bacillus subtilis WB600，在宿主菌中成功实现L-天冬酰胺酶II的重组表达。另外修改组合策略可提高L-天冬酰胺酶在宿主体内的表达水平。巴斯德毕赤酵母表达系统可以对自身表达的蛋白质进行加工，生产的L-天冬酰胺酶更加安全，目前Nagarajan A[5]等人从内生真菌中成功筛选并分离到新型无谷氨酰胺酶L-天冬酰胺酶。酵母表达系统产可以适应高密度发酵，重组体系产品易于纯化，是目前一种具有较高应用潜力的的L-天冬酰胺酶表达体系。

参考文献：

[1] ?ebnem E，Hikmet G.Cloning，isolation and expression of l -asparaginase gene（ansB）in different gram-negative bacteria expressing Vitreoscilla hemoglobin[J].Curr Opin Biotech，2011，22.

[2] Vijay B，Raju K J.Production of L-asparaginase by Aspergillus terreus MTCC 1782 under solid state fermentation using pearl millet and finger millet as mixed substrate[J]J Chem，Biol Phys Sci.2015，5（1）：366-377.

[3] 梁毅偈，孙运军，胡胜标，等.大肠杆菌Nissle1917L-天冬酰胺酶Ⅱ基因在大肠杆菌BL21中的表达与抗肿瘤活性[J].微生物学通报，2014，41（4）：607-613.

[4] Feng Y，Liu S，Jiao Y，et al. Enhanced extracellular production of L-asparaginase from Bacillus subtilis 168 by B.Subtilis WB600 through a combined strategy[J]Appl Microbiol Biot.2017，101（4）：1509-1520.

[5]Nagarajan A，Thirunavukkarasu N，Suryanarayanan T S，et al.Screening and isolation of novel glutaminase free L-asparaginase from fungal endophytes[J] Res J Microbiol.2014，9（4）：163-176.

（作者單位：华南师范大学（石牌校区）生命科学学院）