南海红树林内生真菌Sk-3代谢产物研究

杨建香

（桂林师范高等专科学校，广西 桂林 541001）

南海红树林内生真菌Sk-3代谢产物研究

杨建香

（桂林师范高等专科学校，广西 桂林 541001）

研究南海红树林内生真菌Sk-3的代谢产物，采用反复硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20凝胶色谱法等进行分离纯化，并通过理化常数测定和光谱分析鉴定其化学结构。从南海红树林内生真菌Sk-3的菌体中分离得到4个代谢产物。经波谱解析，分别为3-（羟甲基）-6，8-二甲氧基香豆素（1），4-（Hydroxymethyl）-7-methoxy-6-methyl-1（3H）-isobenzofuranone（2），环（苯丙-苯丙）二肽（3），环（苯丙-酪）肽（4）。所有化合物均首次从南海红树林内生真菌Sk-3中分离得到。

红树林；内生真菌；代谢产物

人类生存在一个被海洋覆盖的星球， 海洋占地球总面积的71%， 全部水源的97%都在海洋之中［1］，海洋中蕴藏着约5亿种生物， 是人类丰富的药源生物资源。海洋微生物生存环境迥异于陆地环境，如高盐、高压、低温、寡营养等，在此环境下存活的海洋微生物具有独特的代谢途径和机体防御机制，其产生的代谢物的化学结构具有极大的复杂性和多样性。这就为从海洋微生物及其代谢产物中筛选和提取具有特异化 学结构的天然活性物质提供了极大的可能性。

本文对南海红树林内生真菌Sk-3代谢产物进行研究，从菌体中分离得到4个化合物：3-（羟甲基）-6，8-二甲氧基香豆素 （1），4-（hdroxymethyl） -7-methoxy-6-methyl-1（3H）-isobenzofuranone（2），环（苯丙-苯丙）二肽（3），环（苯丙-酪）肽（4）。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

INOVA-500NB超导核磁共振谱仪和INOVA-500NB核磁共振仪，VG ZAB-HS双聚焦质谱仪，Thermo DSQ电子轰击电离质谱仪，Thermo MAT95XP高分辨质谱仪，X-4数字显示显微熔点测定仪。

所用试剂均为化学纯，溶剂重蒸后使用。柱层析硅胶为0.038～0.045mm硅胶，硅胶H，薄层硅胶GF254。

1.2 菌种培养

红树林内生真菌Sk-3采自中国山口，经鉴定为拟茎点霉菌（Phomopsis sp.），发酵培养基为葡萄糖10g·L-1，蛋白胨2g·L-1，酵母膏1g·L-1，粗海盐2g·L-1，pH 7.5。500mL三角瓶内装培养基300mL，1.25×105Pa灭菌25min后接种150L，在25℃静置培养35d。分别收集发酵液和菌体。

1.3 提取与分离

150L发酵物过滤得菌体和发酵液，发酵液浓缩后用乙酸乙酯充分萃取，菌体用甲醇多次浸泡。提取浓缩物分别以体积比1∶2拌硅胶（0.038～0.048mm）进行柱层析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇进行梯度加压洗脱。收集各组分再经反复柱层析，制备薄层层析、重结晶等方法进行分离纯化。从菌体粗提物（约45g）分离得到化合物1 （8mg），2 （10mg），3 （10mg），4 （13mg） 。

1.4 化合物的实验数据

化合物1：淡黄色晶体，mp：179～181℃。1H NMR（Acetone-d6，300Hz） δ：7.86 （1H，t，J=2.0Hz），6.78（1H，d，J=3.0Hz），6.79（1H，d，J=3.0Hz），4.52（2H，dd，J=5.5，2.0Hz），4.44（OH，d，J=5.5Hz），3.86（3H，s），3.95（3H，s）。13C NMR spectrum （Acetone-d6，75 MHz） δ：160.6（C），157.4（C），148.9（C），138.4（C），137.9（CH），130.9（C），120.9（C），103.2（CH），101.6（CH），59.8（CH2），56.5（CH3），56.2（CH3）。Mass spectrum （EI，70eV，m/z，Irel，%）：236（100.0），207（22.5），193（4.4），191（17.5），179（7.5），166（6.3），137（6.3），133（5.3）。分子式C12H12O5。

化合物2：黄色粉末，mp：264～265℃。1H NMR spectrum （Acetone-d6，400 MHz）：2.29（3H，s），2.60（1H，br），3.98（3H，s），4.68（2H，s），5.33（2H，s），7.48（1H，s）。13C NMR spectrum （Acetone-d6，125MHz）：170.3（C），158.0（C），147.2（C），137.2（CH），133.3（C），132.9（C），118.8（C），70.2（CH2），63.3（CH3），62.9（CH2），16.5（CH3）。

化合物3：白色针晶，mp：120～122℃。1HNMR（DMSO-d6， 300 MHz）δ：7.90（s，1H，NH），7.28（dd，7.5，7.0Hz，2H），7.23（dd，7.5，7.0Hz，1H），7.11（d，7.5Hz，2H），4.05（m，1H），2.92（dd，13.5，7.5Hz，1H），2.23（dd，13.5，7.5Hz，1H）。FABMS（m/z）：295 ［M+H］+，279，156，120，89，77，51。

化合物4：白色固体，mp：291～293℃。EIMS （m/z）：310［M］+。1H NMR （DMSO-d6，300 MHz）δ：9.06（1H，s），7.65（2H，brs），7.28 （2H，t，J=7.5Hz），7.20（1H， t，J=7.5Hz），7.06（2H，d，J=7.0Hz），6.86（2H，d，J=8.5Hz），6.68（2H，d，J=8.5Hz），3.96（1H，m），3.88（1H，m），2.63（2H，dd，J=14.0，7.0Hz），2.24（2H，dd，J=14.0，7.0Hz）。13C NMR （DMSO-d6，75MHz） δ：165.9，165.8，155.8，136.5，130.6，129.6，127.9，126.4，114.8，55.7，55.5，39.2，38.9。

2 结果与讨论

化合物1：EIMS显示分子离子峰236，可知分子式为C12H12O5。1HNMR显示该化合物有2个间位的苯环氢［δH6.78（1H，d，J=3.0），6.79（1H，d，J=3.0）］、1个双键氢［δH7.86 （1H，t，J=2.0）］、1个连在不饱和碳上的CH2［δH4.52 （1H，dd，J=5.5，2.0）］，1个活泼氢［δH4.44（1H，d，J=5.5）］，2个连在芳香环上的甲氧基［δH3.86 （3H，s），3.95 （3H，s）］。13C NMR显示该化合物有1个香豆素的骨架。2DNMR并与文献对照后确定化合物的结构为3-（hydroxymethyl）-6，8-dimthoxy-2H-chromen-2-one［2］。

化合物2：由NMR数据，以及HR-EIMS谱中分子离子峰为208.0723［M］+（计算值208.0730），确定分子式为C11H12O4，不饱和度U=6。13CNMR 和DEPT显示分子中有2个CH3，2个CH2，1个CH，CH（δ 7.48，s）说明是苯环上的H，CH2（δ 5.33，s）和CH2（δ 4.68，s）以及CH3（δ 3.98，s）说明它们都与氧原子相连。δ 170.3（C）可能为酯基。其波谱数据与文献［3］对照基本一致。

化合物3：白色针状晶体，溶解性能很差，TLC碘熏显白点，拖尾，熔点＞290℃。FABMS给出295［M+H］+，结合氢谱提示分子式为C18H18N2O2，不饱和度为11。IR谱提示存在活泼氢信号［ν3190（brs）cm-1］和羰基信号（ν1660cm-1）。氢谱共给出9个质子信号，说明化合物是对称的。从氢谱7.28（dd，7.5，7.0Hz，2H）、7.23（dd，7.5，7.0Hz，1H）、7.11（d，7.5Hz，2H）看出化合物存在一个单取代苯环，δ4.05（m，1H）是连杂原子的饱和次甲基质子信号，δ2.23（dd，13.5，7.5Hz，1H）和2.92（dd，13.5，7.5Hz，1H）是苄亚甲基质子的特征，δ7.90（brs，1H）是活泼NH信号，据此推出该化合物为环（苯丙-苯丙）二肽。进一步与文献［4］对比得到确证。

化合物4：白色固体，EI-MS显示其分子量为310，结合NMR分析得出化合物的分子式为C18H18N2O3。通过1H NMR（DMSO，TMS），δ 7.28 （2H，t，J=7.5Hz），δ7.20 （1H， t， J=7.5Hz），δ7.06 （2H， d，J=7.0Hz）推断有一个单取代的苯环，δ 7.65 （2H， brs）为2个活泼氢， δ 3.96 （1H， m）和δ 3.88 （1H，m）为和杂原子相连的氢，δ 6.86 （2H， d， J=8.5Hz）和δ 6.68 （2H，d， J=8.5Hz）暗示还有4个对位取代的苯环上的氢，δ 9.06（1H， s）可能为酚羟基。13C NMR中δ 165.9初步可以证实是酰胺中的羰基信号，δ 130.6、129.6、127.9、114.8也进一步证实了分子中苯环的存在，与1H NMR分析得出化合物中有一个单取代苯环和一个对位二取代苯环相一致。对照文献［5］，确定化合物4为环（苯丙-酪）肽。

［1］ Barnes RSK， Hughes RN. An Introduction to MarineEcology［M］. Chichester， UK： Wiley-Blackwell， 1999： 1-3.

［2］ Ayer WA & Racok JS. The metabolites of Talaromyces flavus. Part 1. Metabolites of the organic extracts［J］. Can. J. Chem.， 1990， 68 （11）： 2085-2094.

［3］ Y.S.Tsantrizos， K. K. Ogilvie， A.K.Watson. Phytotoxic metabolites of Phomop-sis convolvulus， a host-specific pathogenof field bindweed［J］. Can. I. Chem.， 1992（70）： 2276-2284.

［4］ Abell C， Garson M J， Leeper F J， Staunton J. Biosynthsis of the fungal metabolites alternariol， mellein， rubrofusarin，and 6-methylsalcylic acid from CD3CO2H［J］. J. Chem. Soc.，Chem. Commun.， 1982： 1011-1013.

［5］ 王双明， 谭宁华， 杨亚滨，等. 三七环二肽成分［J］.天然产物研究与开发， 2004，16（5）：383-386.

Metabolites of Mangrove Endophytic Fungus Sk-3 from South China Sea

YANG Jian-xiang
(Department of Editorial, Guilin Normal College, Guilin 541002, China)

Secondary metabolites of mangrove endophytic fungus No. Sk-3 from the south China sea was studied. The compounds were isolated by column chromatography and identifi ed on the basia of physic-chemical constants and spectral analysis. Four metabolites were obtained and elucidated: 3-(hydroxymethyl)-6,8-dimthoxy-2H-chromen-2-one (1), 4-(Hydroxymethyl) -7- methoxy- 6-methyl-1(3H)-isobenzofuranone(2), [cyclo-(Phe-phe) (3), cy lo ( Phe -Tyr) (4). The four metabolites were obtained from endophytic fungus No. Sk-3 for the fi rst time.

mangrove; endophytic fungus; metabolites

O 629

A

1671-9905（2015）10-0010-03

广西教育厅科研项目（KY2015LX598）

杨建香（1979-），女，汉族，博士，教授，主要从事天然产物化学研究。E-mail： 791011@126.com，电话：18978660936

2015-08-14