γ-聚谷氨酸发酵工艺研究

李宏杰，方军，蒋彩霞，沈康

（杭州中美华东制药有限公司，浙江杭州310011）

γ-聚谷氨酸发酵工艺研究

李宏杰，方军，蒋彩霞，沈康

（杭州中美华东制药有限公司，浙江杭州310011）

采用发酵技术，利用枯草芽孢杆菌发酵生产γ-聚谷氨酸，对γ-聚谷氨酸发酵工艺进行研究。主要研究碳源、氮源、装液量、接种量、发酵时间、pH以及前体谷氨酸钠和促进剂氯化铵对γ-聚谷氨酸发酵的影响。前期研究表明，γ-聚谷氨酸发酵液黏度与其产量线性相关，故本研究中采用发酵液黏度作为γ-聚谷氨酸产量的衡量指标。通过单因素试验和正交试验，对发酵培养基和发酵条件进行优化，最后得到最佳发酵培养基配方和发酵条件。通过单因素及正交试验，确定最佳发酵培养基配方为：葡萄糖4%，酵母膏0.5%，谷氨酸钠3%，MgSO4·7H2O 0.025%，K2HPO40.2%，氯化铵0.3%；最佳发酵条件为：初始pH 9.5，装液量50mL，接种量6%，摇床转速为220 r/min，37℃振荡培养72 h。

γ-聚谷氨酸；枯草芽孢杆菌；发酵工艺

γ-聚谷氨酸（γ-Poly glutamic acid，γ-PGA）是由L-谷氨酸（L-Glu）、D-谷氨酸（D-Glu）单体通过γ-羧基与α-氨基间的γ-酰胺键聚合而成的一种多肽分子。由于其具有增稠、乳化、成膜、保湿、絮凝、粘合、无毒、水溶、生物可降解、无毒副作用等特性，适用于食品、化妆品、生物医学、环境保护等领域。近年来随着对γ-聚谷氨酸的深入研究，作为一种新型的高分子生物制品，愈来愈显现出广阔的研究及应用前景。本课题拟对γ-聚谷氨酸进行发酵生产，主要对γ-聚谷氨酸发酵工艺进行研究，旨在提高γ-聚谷氨酸产量，为γ-聚谷氨酸工业化生产提供技术参考。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1主要化学试剂

葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、可溶性淀粉、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、谷氨酸钠、氯化铵等均为市购。

1.1.2主要仪器

电子天平TE612-L：北京赛多利斯仪器系统有限公司；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器SYQ-DSX-280：上海申安医疗器械厂；超净工作台SW-CJ-1F：苏州江东精密仪器有限公司；电热恒温培养箱DPX-9082B-1型：上海福玛实验设备有限公司；流变仪DV-III：美国Brookfield公司等。

1.1.3试验菌种

试验菌种：枯草芽孢杆菌，杭州中美华东制药有限公司实验室保存。

1.1.4培养基

1）斜面培养基（LB培养基）：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖0.1%，琼脂2%，酵母粉0.2%，pH 7.5；灭菌条件：121℃，20 min。

2）种子培养基：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，谷氨酸钠2%，MgSO4·7H2O 0.025%，K2HPO40.2%，pH 7.5；灭菌条件：121℃，20 min。

3）发酵培养基：葡萄糖4%，酵母膏0.8%，谷氨酸钠3%，MgSO4·7H2O 0.025%，K2HPO40.2%，pH 7.5；灭菌条件：121℃，20 min。参考，待优化。

1.2培养方法

斜面培养：挑取枯草芽孢杆菌保藏菌种接种于斜面培养基中，37℃静置培养13 h～24 h，作为一次活化菌种。将一次活化菌种接种于新鲜斜面培养基中，37℃下静置培养13 h～24 h，作为二次活化菌种。

种子培养：将二次活化菌种接种于种子培养基，37℃、220 r/min，振荡培养16 h～24 h作种子液。

发酵培养：按所需的接种量将种子液接种于发酵培养基中，37℃、220 r/min，振荡培养48 h，得到含有γ-聚谷氨酸的发酵液。

1.3试验方案

1.3.1单因素试验优化发酵培养基

1）碳源：考察不同碳源碳源对γ-聚谷氨酸产量的影响，碳源分别为葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、可溶性淀粉，其他条件相同，每组试验3个平行和1个空白。测定发酵液的黏度［4］，确定最佳碳源。

2）氮源：考察不同氮源对γ-聚谷氨酸产量的影响，氮源分别为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、固体豆浆，其他条件相同，每组试验3个平行和一个空白。测定发酵液的黏度，确定最佳碳源。

3）谷氨酸钠含量：考察不同谷氨酸钠含量对γ-聚谷氨酸产量的影响，其含量分别为0、1%、2%、3%、4%，其他条件相同，每组试验3个平行。测定发酵液黏度，确定最适谷氨酸钠含量。

4）氯化铵含量：考察不同氯化铵含量对γ-聚谷氨酸产量的影响，其含量分别为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，其他条件相同，每组试验3个平行。测定发酵液黏度，确定最适氯化铵含量。

1.3.2单因素试验优化发酵条件

1）初始pH：考察不同初始pH对γ-聚谷氨酸产量的影响，pH分别为6、7、8、9，其他条件相同，每组实验3个平行。测定发酵液黏度，确定最适pH的范围。

2）接种量：考察不同的接种量对γ-聚谷氨酸产量的影响，接种量分别为2%、3%、5%、7%、10%其他条件相同，每组试验3个平行。测定发酵液黏度，确定最适接种量范围。

3）装液量：考察不同的装液量对γ-聚谷氨酸产量的影响，装液量分别为30、50、70、100 mL其他条件相同，每组试验3个平行和1个空白。测定发酵液黏度，确定最适装液量的范围。

4）发酵时间：考察不同的发酵时间对γ-聚谷氨酸产量的影响，发酵时间分别为24、48、72、96 h，其他条件相同，每组试验3个平行和1个空白。测定发酵液黏度，确定最适装液量的范围。

1.4正交试验发酵工艺优化

1.4.1正交试验对发酵培养基成分配比进行优化

本实验对单因素试验发酵培养基的最佳碳源（A）、谷氨酸钠含量（B）和氮源（C）做其配比的正交实验（三因素三水平）。其他条件相同，每组实验3个平行，测定发酵液黏度，确定最佳培养基成分。

1.4.2正交试验对发酵条件进行优化

本实验对单因素试验中最佳培养基起始pH（A）、装液量（B）、接种量（C）和发酵时间（D）做正交试验（四因素三水平），其他有条件相同，每组实验3个平行，测定发酵液黏度，确定最佳发酵条件。

2结果

2.1单因素试验结果

2.1.1单因素试验优化发酵培养基

按1.4.1所述方法分别研究碳源、氮源、谷氨酸钠含量、氯化铵含量对γ-聚谷氨酸产量的影响，结果如图1、图2、图3、图4所示。

图1　碳源对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.1Effects of carbon sources on the γ-PGA Production

图2　氮源对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.2Effects of Nitrogen sources on the γ-PGA production

图3　谷氨酸钠含量对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.3Effects of Monosodium glutamate on the γ-PGA Production

图4　氯化铵含量对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.4Effects of NH4Cl on the γ-PGA production

由图可知，最佳碳源为葡萄糖，则最佳氮源为酵母膏，最佳谷氨酸钠含量为3%，最佳氯化铵含量为0.3%。

2.1.2单因素试验优化发酵条件

按1.4.1所述方法分别研究初始pH、接种量、装液量、发酵时间对γ-聚谷氨酸产量的影响，结果如图5、图6、图7、图8所示。

由图可知，最佳初始pH为9，最佳接种量为5%，最佳装液量为50 mL，最佳发酵时间为72 h。

2.2正交试验发酵工艺优化结果

2.2.1正交试验对发酵培养基成分配比进行优化

按2.4.1所述方法对发酵培养基成分配比进行优化，因素水平表见表1，结果与分析见表2。

图5　初始pH对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.5Effects of initial pH on the γ-PGA Production

图6　接种量对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.6Effects of Inoculation quantity on the γ-PGA production

图7　装液量对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.7Effects of Liquid loading on the γ-PGA Production

图8　发酵时间对γ-聚谷氨酸产量的影响Fig.8Effects of fermentation time on the γ-PGA production

由表2可以看出，B因素是影响指标值的最主要因素，各因素对γ-聚谷氨酸产量影响主次顺序为B＞A＞C，最佳组合为A2B2C2，同时相同条件做表2中最佳组合A2B2C3，得到发酵液的黏度分别为2.097 mPa·s和2.103 mPa·s，黏度相差不大，酵母膏的量影响不大，考虑成本，选最佳组合为A2B2C2。

表1　L9（33）正交试验因素水平表Table 1Factor level L9（33）of the orthogonal test%

表2　L9（33）正交试验结果Table 2Result of the orthogonal test L9（33）

2.2.2正交试验对发酵条件进行优化

按1.4.2所述方法对发酵条件进行优化，因素水平见表3，结果与分析见表4。

表3　L9（34）正交试验因素水平表Table 3Factor level L9（34）of the orthogonal test

由表4可知，C因素是影响指标值的最主要因素，各因素对γ-聚谷氨酸产量影响主次顺序为C'＞B＞'A'＞D'，最佳组合为A3'B2'C3'D2'。相同条件做A3'B2'C3'D2'和表4中最佳组合A2'B2'C3'D1'，得到发酵液的黏度分别为1.937mPa·s和1.903mPa·s，则最佳组合为A3'B2'C3'D2'。

表4　L9（34）正交试验结果Table 4Result of the orthogonal test L9（34）

3结论

通过单因素试验和正交试验得到最佳发酵工艺：葡萄糖4%，酵母膏0.5%，谷氨酸钠3%，MgSO4·7H2O 0.025%，K2HPO40.2%，氯化铵0.3%，初始pH9.5，121℃灭菌20 min，250 mL三角瓶，装液量50 mL，接种量6%，摇床转速为220 r/min，37℃振荡培养72 h。

［1］G G Meynell，E Meynell.The Biosynthesis of Poly d-glutamic Acid apsular Material of Bacillus anthracis［J］.General Microbiology.1966，43（1）:119-128

［2］陈咏竹，孙启玲.γ-多聚谷氨酸（γ-PGA）生产菌的诱变选育及重金属吸附的应用研究［D］.四川:四川大学，2005

［3］曹旭，徐志南.γ-多聚氨酸的异源表达及发酵工艺的研究［D］.杭州:浙江大学，2007

［4］李文靖.γ-聚谷氨酸发酵及提取工艺研究［D］.济南:山东轻工业学院，2010

Study on Fermentation Process of γ-PGA

LI Hong-jie，FANG Jun，JIANG Cai-xia，SHEN Kang
（Hangzhou East China Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Hangzhou，310011，Zhejiang，China）

In this study，the fermentation technology was used to produce γ-PGA with Bacillus subtilis fermentation，and the fermentation process technology of γ-PGA is studied.The influence of the output of γ-PGA was the main researched，such as the carbon source，nitrogen source，liquid volume，inoculation，fermentation time，pH and sodium glutamate precursor and the promoter of ammonium chloride.Previous studies had shown that γ-PGA fermentation broth viscosity linearly related to its production，the viscosity of the fermentation broth was used as γ-PGA output measure.The optimum medium composition and the optimum fermentation conditions scope were determined by single factor experiment orthogonal experiment.The optimum medium of the fermentation obtained through the single factor and orthogonal experiments was：4%glucose，0.5%yeast extract，sodium glutamate 3%，MgSO47H2O 0.025%，K2HPO40.2%，ammonium chloride，0.3%；Optimum fermentation conditions were：initial pH 9.5，medium volume 50mL，inoculum size 6%，rotation speed of 220 r/min，37℃oscillator cultured 72 h.

γ-poly glutamic acid；Bacillus subtilis；fermentation process

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.020

2015-02-26

李宏杰（1978—），男（汉），工程师，本科，研究方向：药物发酵工艺研究。