响应曲面法优化土大黄总黄酮超声提取工艺

卫亚丽，吴娇，邓永苹

（贵州民族大学化学与环境科学学院贵州少数民族医药资源开发与利用重点实验室，贵州贵阳550025）

响应曲面法优化土大黄总黄酮超声提取工艺

卫亚丽，吴娇，邓永苹

（贵州民族大学化学与环境科学学院贵州少数民族医药资源开发与利用重点实验室，贵州贵阳550025）

优化土大黄总黄酮的提取工艺。以土大黄为材料，在单因素试验结果的基础上，采用三因素三水平的Box-Behnken响应曲面设计。土大黄总黄酮超声提取的最佳工艺参数：乙醇浓度54%，提取时间110 min，物料比为1∶99（g/mL），且乙醇的浓度对总黄酮提取率的影响最大。在最佳优化条件下土大黄总黄酮得率为（16.7±0.03）mg/g，为预测值的96.5%，可用于土大黄总黄酮的提取。

土大黄；总黄酮；响应曲面法；超声提取法

土大黄为蓼科酸模属植物土大黄（Rumex madaio Makino［R.daiwoo Makino］），以根和叶入药，具有清热解毒，止血，祛瘀，通便，杀虫功效。研究表明［1-3］：土大黄主要的化学成分为蒽醌类、黄酮类、二苯乙烯类、糖苷类等，其中黄酮类化合物具有抗炎症［4］、抗菌［5］、抗过敏、抗氧化［6］、抗病毒［7］等多种活性，还有抗癌、镇痛、抗肿瘤［8］、治疗心脑血管疾病［9-10］等药用保健功能，具有比较大的开发价值。目前关于黄酮类物质的提取、分离、纯化、含量测定的研究报道较多［11-13］，但目前土大黄总黄酮的提取工艺优化研究笔者鲜见国内外报道。本研究利用响应曲面优化土大黄的超声提取工艺，以期为土大黄总黄酮提取工艺优化提供理论参考，为土大黄的综合开发利用提供基础资料。

1材料与方法

1.1仪器与材料

1.1.1仪器

756紫外可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；XFB500粉碎机：湖南中诚制药机械厂；超声器波清洗仪SB-100：上海比朗仪器有限公司。

1.1.2材料

芦丁标准品（＞98%）：贵州迪大生物科技有限责任公司；无水乙醇、盐酸、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝均为分析纯；土大黄购自安徽毫州中药材市场。

1.2方法

1.2.1对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品0.010 0 g，置10 mL容量瓶中，加50%乙醇定容，摇匀，即得芦丁对照品溶液（1 mg/mL）。

1.2.2标准曲线的绘制

精密吸取芦丁对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于10 mL的容量瓶中，再分别加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL 50%的乙醇，加入5%的亚硝酸钠0.5 mL，摇匀，静置6 min，再加入10%的硝酸铝0.5 mL，静置6 min，然后加入4%氢氧化钠4.0 mL，最后用50%乙醇定容，摇匀，静置15 min后，在510 nm波长处测定吸光度。以芦丁的浓度（x）为横坐标，吸光度y（Abs）为纵坐标制作标准曲线，计算回归方程。

1.2.3土大黄总黄酮提取

称取土大黄200 g在60℃真空干燥至恒重、粉碎、过60目筛、备用。取0.5g样品粉末，精密称定，置于三角瓶内，加入50%乙醇30 mL，40℃下超声90 min，抽滤、洗涤，最后定容于50 mL容量瓶中，用于总黄酮含量测定。

1.2.4总黄酮的含量测定

总黄酮含量测定的方法为经典亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法。取样品溶液0.2 mL于10 mL容量瓶内，按1.2.2标准曲线下的方法进行测定。

1.2.5单因素试验设计

选择提取温度、提取时间、物料比和乙醇浓度这4个对土大黄总黄酮提取工艺有影响的参数进行单因素试验。具体条件见表1。

表1　单因素设计Table 1The single factors design conditions

1.2.6响应曲面试验设计

根据单因素试验选择的响应曲面试验范围，选定提取温度为40℃，利用Design-Expert8.0软件，以提取时间（X1，min）、乙醇浓度（X2，%）、物料比（X3，g/mL）作为变量，以-1、0、1代表变量水平，进行Box-Behnken设计三因素三水平实验方案，见表2。试验数据用Design Expert分析。

表2　土大黄总黄酮提取因素与水平Table 2Factors and levels of total flavonoids extraction from Rumex madaio Makino

2结果与分析

2.1标准曲线

芦丁的标准曲线见图1。

图1　芦丁标准曲线Fig.1Standard curve of rutin

以芦丁的浓度（x）为横坐标，吸光度y（Abs）为纵坐标制作标准曲线，芦丁标准线性回归方程为y= 11.182x-0.000 8，R=0.999，芦丁标准溶液浓0.02mg/mL～0.10 mg/mL范围时，线性关系良好。

2.2单因素对土大黄总黄酮提取率的影响

2.2.1时间对土大黄总黄酮提取率的影响

时间对土大黄总黄酮提取率的影响结果见图2。

图2　提取时间对土大黄总黄酮提取率的影响Fig.2Effect of extraction time on the extraction rateof total flavonoids from Rumex madaio Makino

由图2可知，当时间在30 min～90 min之间时，土大黄总黄酮提取率随提取时间的延长而呈上升趋势，90 min时达到最大值，超过90 min土大黄总黄酮的提取率而逐渐下降。这说明总黄酮浸出过程与时间密切相关，时间短产物溶解不充分，但时间过长又会引起黄酮类物质结构的变化进而使提取率降低。

2.2.2乙醇浓度对土大黄总黄酮提取率的影响

乙醇浓度对土大黄总黄酮提取率的影响结果见图3。

图3　乙醇浓度对土大黄总黄酮提取率的影响Fig.3Effect of ethanol concentration on the extraction rateof total flavonoids from Rumex madaio Makino

由图3可知，当乙醇浓度在25%～50%之间时，土大黄总黄酮提取率随乙醇浓度的升高而呈上升趋势，这可能是因为随着乙醇浓度的提高，溶于乙醇中的总黄酮溶出量增加，提取率随之提高，当乙醇浓度超过50%时，总黄酮提取率随乙醇浓度的升高而逐渐降低。当乙醇浓度增加到一定条件时，溶于乙醇中的总黄酮溶出量降低，可能是随着乙醇浓度升高，其极性与黄酮类物质的极性相差逐渐增大，从而导致溶液对黄酮类化合物溶解度降低，同时一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分等溶出增多，也不利于黄酮类化合物提取测定，进而影响提取率［14］。因此乙醇浓度选用50%为宜。

2.2.3温度对土大黄总黄酮提取率的影响

温度对土大黄总黄酮提取率的影响见图4。

图4　提取温度对土大黄总黄酮提取率的影响Fig.4Effect of extraction temperature on the extraction rateof total flavonoids from Rumex madaio Makino

由图4可知，当温度在常温到40℃之间时，土大黄总黄酮的提取率随温度的升高呈上升趋势，在40℃时达到最大，当超过40℃之后，土大黄总黄酮的提取率随着温度的升高而下降。这可能是因为当温度温度升高到一定程度可能会破坏样品中黄酮类物质的结构造成样品中黄酮类物质的损失。

2.2.4物料比对土大黄总黄酮提取率的影响

物料比对土大黄总黄酮提取率的影响结果见图5。

由图5可知，在物料比为1∶10（g/mL）～1∶100（g/mL）之间时，土大黄总黄酮的提取率呈上升趋势，当物料比为1∶100（g/mL）时提取率达到最大。在物料比为1∶10（g/mL）～1∶40（g/mL）之间，提取率的升高趋势非常明显，在物料比为1∶40（g/mL）～1∶100（g/mL）之间，提取率的升高趋势并不是很明显，这可能是因为是当提取溶剂量太大时，黄酮的溶出已基本达到平衡，再增加溶剂量，提取效果并不能明显提高。

图5　物料比对土大黄总黄酮提取率的影响Fig.5Effect of material-to-liqud ratio on the the extraction rateof total flavonoids from Rumex madaio Makino

2.3土大黄总黄酮提取工艺优化

2.3.1响应面实验设计与结果

根据Box-Benhnken中心组合设计原理，综合单因素试验结果，选取提取时间、乙醇浓度、物料比3个因素，在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法，研究三因素不同组合对土大黄总黄酮提取率的影响。试验设计及结果见表3，方差分析见表4。

表3　土大黄总黄酮提取的响应曲面设计与结果Table 3Response surface design and results of total flavonoids extraction from Rumex madaio Makino

利用Design-Expert8.0软件对试验结果进行回归拟合，得到土大黄总黄酮提取率对以上3个因素的二次多项回归模型：土大黄总黄酮提取率Y（%）=-25.747 29+0.546 67X1+4.415 33X2-0.098 750X3+0.025 333X1X2-1.041 67×10-3X1X3-2.700 00×10-3X2X3-8.45370×10-3X12-0.060893X22+6.05729×10-3X32。对该模型进行方差分析，结果见表4。由表4可以看出，模型F值=7.89，p=0.003 9，说明该回归模型达到极显著（p＜0.01）；失拟项F值为3.51，p=0.052＞0.05，不显著，说明该模型可以用于土大黄总黄酮提取优化。同时各因素中一次项X2显著，X3极显著，二次项X1X2显著，X22极显著，该模型相对应的回归项P值0.003 9小于0.01，具有极度的显著性，表明模型是有效的。

表4　响应曲面二次回归模型的方差分析Table 4Results of the analysis of variance to the response surface quadratic model

2.3.2响应曲面分析

根据回归方程，作响应曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状，分析提取时间、乙醇浓度和物料比对土大黄总黄酮提取率的影响，响应曲面如图6所示。

图6两因素之间交互作用对土大黄总黄酮提取含量影响的响应面图Fig.6Response surface plots showing the effects of two factors interaction on the extraction rate of total flavonoids from Rumex madaio Makino

图6直观大反映了各因素对响应值得影响，乙醇浓度和物料比的相互作用较显著。

采用Design-Expert 8.05软件的响应优化功能对实验结果进行优化，得到模型最优解：由软件可得土大黄总黄酮的最佳提取工艺为：提取时间110.42 min，物料比为1∶99.13（g/mL），乙醇浓度为53.89%，此时总黄酮提取率为17.3 mg/g。

2.4验证试验

为了试验的可操作性，结合单因素试验结果并考虑到实际操作的方便性，选用乙醇浓度为54%，提取时间110 min，物料比为1∶99（g/mL），在该实验条件下，取0.5 g土大黄进行总黄酮的提取，试验重复3次，平均值为（16.7±0.03）mg/g。因此，利用响应曲面分析方法对土大黄中总黄酮的提取工艺进行优化，可获得最优的工艺参数，能有效减少工艺操作的盲目性，从而为进一步的试验研究奠定基础，为土大黄的开发利用提供依据。

表5　试验验证响应面优化条件Table 5Conformation results of the optimized extraction conditions

4讨论

本文通过单因素和响应曲面法讨论了土大黄总黄酮的提取工艺条件，利用Design-Expert软件建立了土大黄总黄酮提取率与乙醇浓度、提取时间及物料比的二次多项回归模型，检验证明该模型合理可靠，能较好的预测土大黄总黄酮的提取率。优化的最佳工艺参数为：土大黄总黄酮超声提取的最佳工艺参数：乙醇浓度54%，提取时间110min，物料比为1∶99（g/mL），土大黄总黄酮的提取率为（16.7±0.03）mg/g，与预测值17.3 mg/g非常接近，可达预测值的96.5%。说明该模型比较可靠。

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Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Rumex madaio Makino

WEI Ya-li，WU Jiao，DENG Yong-ping
（College of Chemistry and Environmental Science，Gui zhou Minzu University Key Laboratory of Development and Using Medicine Resources of Ethnic Minority Groups of Guizhou，Guiyang 550025，Guizhou，China）

To optimize the process of total flavonoids from Rumex madaio Makino.Basis on the results of the single factor experiments，Rumex madaio Makino was used as materials to optimize the extraction conditions of total flavonoids by using response surface methodology involved a three leves，three variable Box-Behnken design.The optimum conditions of total flavonoids extraction were 54%ethanol as extraction solvent，materialratio 1∶99（g/mL）and extraction time 110 min.Under the optimum conditions，the experimental total flavonoids content of Rumex madaio Makino tested was（16.7±0.03）mg/g，which was well matched with the predicted content.The optimum conditions can be used to extract the total flavonoids from Rumex madaio Makino.

Rumex madaio Makino；total flavonoids；response surface methodology；ultrasonic extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.14.006

2015-04-28

贵州省科技厅与贵州民族大学联合基金［黔科合J字LKM（2012）04］

卫亚丽（1977—），女（汉），副教授，在读博士，研究方向：药物分析。