牦牛AQP4基因CDS序列的克隆及其生物信息学特征分析

刘健锋丁艳平侯博儒王建林邵宝平

（1. 兰州大学生命科学学院 动物学与发育生物学研究所，兰州 730000；2. 西北师范大学生命科学学院，兰州 730070；3. 兰州大学第二临床医学院，兰州 730030）

牦牛AQP4基因CDS序列的克隆及其生物信息学特征分析

刘健锋1丁艳平2侯博儒3王建林1邵宝平1

（1. 兰州大学生命科学学院 动物学与发育生物学研究所，兰州 730000；2. 西北师范大学生命科学学院，兰州 730070；3. 兰州大学第二临床医学院，兰州 730030）

为了研究高原动物对青藏高原高寒、低氧等极端生境的适应机理，进一步探讨高原动物对高原反应——高原脑水肿抗性的分子机理，运用基因克隆与生物信息学相关技术和方法，对牦牛脑AQP4（水通道蛋白4，AQP4）基因CDS全长序列进行克隆、基因序列比对及其生物信息学特征分析。结果表明，牦牛AQP4的CDS含有一个966 bp的开放阅读框，编码322个氨基酸；牦牛AQP4基因编码蛋白分子量34.69 kD，理论等电点（pI）7.59，其编码蛋白含有6次跨膜结构，属于疏水性蛋白；二级结构主要由α-螺旋、延伸及无规则卷曲构成；AQP4基因编码产物氨基酸同源性及系统进化分析发现，牦牛AQP4基因编码氨基酸序列与黄牛、绵羊等物种间同源性较高，系统进化情况与其亲缘关系远近一致。

牦牛；AQP4；基因；CDS区；分子克隆；生物信息学

机体内氧气含量较低是绝大多数疾病尤其是脑疾病最主要的诱发因子之一；高原脑水肿是高原反应中最常见、最重要的临床症状之一。水通道蛋白4（Aquaporin，AQP4）是脑中表达最多、最重要的水通道蛋白，其不仅参与正常脑细胞间隙体积变化、神经细胞迁移、脑脊液循环、细胞代谢产物清除等生理过程，而且在脑水肿的发生与清除中发挥着重要的作用［1-5］。1994年，Hasegawa等［6］首次从大鼠肺中克隆出一种特异性的对汞不敏感的水通道蛋白（Mercury insensitive water channel，MIWC），并将其命名为AQP4（aquaporin-4）；同年，又从大鼠脑中分离出AQP4的cDNA［7］。大量研究表明，AQP4在绝大多数脑疾病尤其是脑水肿的发生、发展及其消除过程中发挥着非常重要的作用。

牦牛是世界最具显著特征的物种之一，是遍布青藏高原最大的哺乳动物，其对高寒、低氧极端生境的适应早已引起国内外广大学者的关注［8，9］。但是，到目前为止，在国内外还尚未见到有关牦牛脑AQP4基因CDS全长序列及其相关生物信息学特征的研究报道。为了明晰高原动物对青藏高原高寒、低氧等极端环境的适应机理，进一步探讨高原动物对高原反应——高原脑水肿抗性的分子机理，而为人类脑疾病的研究提供基础资料，本研究运用基因克隆与生物信息学分析等技术和方法，对牦牛脑AQP4基因CDS全长序列进行了克隆、基因序列比对及生物信息学特征分析。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物为甘肃省甘南州玛曲县屠宰场的健康成年（3-4岁）牦牛，屠宰后立即取其头部，沿矢状面开颅取脑，用无菌生理盐水将组织样迅速冲洗干净后剪成1 cm×1 cm×0.5 cm小块后迅速放入液氮中，带回实验室后转移至-80℃冰箱保存。

Trizol试剂、TaKaRa反转录试剂盒、TaKaRa PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、DL2000 DNA marker、DNA凝胶回收试剂盒、限制性内切酶Hind Ⅲ、SmaⅠ及质粒提取试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；DNase I和DEPC购自Sigma公司（美国），IPTG 及X-Gal购自Promega公司（美国），pMD19-T克隆载体和E.coli DH5ɑ感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牦牛大脑皮质总RNA的提取 称取100 mg牦牛大脑皮质后加入液氮研磨，将研好的组织转移至事先加入Trizol裂解液的离心管中，离心10 min；加入氯仿抽提5 min后离心；加入氯丙醇沉淀15 min后离心；再分别用无水乙醇和75%酒精洗涤后离心；DNase I去除基因组中残留的DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测总RNA的质量，-70℃保存备用。

1.2.2 引物设计与合成 参考GenBank中黄牛AQP4基因cDNA序列（GeneID：516762）设计特异性引物P1和P2，即P1：5'-CCCAAGCTTATGAGTGACA GACCCGCAG-3'；P2：5'-TCCCCCGGGTCATACTGAA GACAACAC-3'，横线部分分别为Hind Ⅲ，Sma Ⅰ内切酶酶切位点序列。扩增引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2.3 RT-PCR扩增 以牦牛大脑皮质总RNA为模板进行逆转录反应，总反应体系10 μL：5×PrimeScript Buffer 2 μL，RNase free dH2O 7 μL，500 ng/ μL总RNA 1 μL，混匀后，37℃ 15 min，85℃ 5 s条件下进行逆转录反应，将产物4℃保存。以逆转录产物为模版，P1、P2为引物，扩增AQP4基因。PCR反应体系25 μL：5×Prime Star Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，上下游引物各0.5 μL，TaKaRa PrimeSTAR HS 0.25 μL，cDNA模 板1 μL，RNase-Free dH2O 15.75 μL。PCR反应条件：98℃预变性2 min；98℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，用DNA片段回收试剂盒对PCR产物回收。

1.2.4 AQP4基因的克隆 回收的PCR产物在T4连接酶的作用下与pMD19-T克隆载体进行连接过夜（12-16 h）。将连接产物转化至感受态E.coli DH2α中，37℃，100 r/min培养1 h，涂于含有Amp、X-gal、IPTG的LB固体培养基上，37℃培养12 h。挑取阳性单克隆接种于含有Amp的LB液体培养基中，37℃，180 r/min过夜培养。用“质粒提取试剂盒”提取质粒后进行用Hind Ⅲ，Sma Ⅰ内切酶进行双酶切鉴定。鉴定成功后将质粒送往上海生工公司进行测序。

1.2.5 生物信息学分析 AQP4基因开放阅读框（ORF）采用NCBI的ORF Finder程序分析，序列比对及同源性分析使用DNAMAN软件及在线NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）；蛋白质特性预测使用Bioedit及Lasergene7.1软件包中的Protean软件；亲水性疏水性预测采用Epasy服务器上的protscale程序（http：//web.expasy.org/protscale/）；蛋白质二级结构预测采用法国里昂CNRS的SOPMA软件（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html），并利用SWISS-MODEL软件（http：//swiss-model.expasy.org/）进行三级结构预测；使用MEGA 4.0软件构建系统进化树，置信度用Boot-strap检验（重复次数为1 000）。

2 结果

2.1 牦牛AQP4基因的PCR扩增

牦牛大脑皮层总RNA用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测到28S、18S和5S 3条带（图1），OD260/OD280平均为1.95，表明RNA完整性较好，没有蛋白质或DNA污染且纯度和浓度适合RT-PCR。牦牛RTPCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测（图2），DNA片段在1 000 bp左右，可能还含有编码区两侧序列，与预期DNA片段（966 bp）大小基本一致，条带清晰且特异性良好，可以进行切胶回收进一步做克隆。

图1 牦牛皮质总RNA的提取

图2 AQP4基因PCR扩增产物的电泳图谱

2.2 牦牛AQP4基因克隆及重组子的鉴定

提取菌液的质粒并用Hind Ⅲ，SmaⅠ内切酶双酶切鉴定重组质粒，得到一条约3 000 bp的pMD19-T线性片段和约1 000 bp的插入片段（图3），与预期的结果完全相同。

图3 重组质粒的双酶切鉴定

2.3 牦牛AQP4基因的序列测定及分析

将双酶切鉴定正确的阳性重组质粒送往上海生工公司测序。测序结果表明，克隆得到的序列在CBI上进行同源性搜索，所得到的目的基因为含牦牛AQP4编码区的序列。应用NCBI的ORF Finder程序对牦牛AQP4基因序列开放阅读框分析，得知AQP4基因含有一个长度为966 bp的开放阅读框，编码322个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA（图4）。

图4 牦牛AQP4基因和编码蛋白的序列

2.4 牦牛AQP4蛋白的生物信息学分析

2.4.1 牦牛AQP4蛋白的理化性质 利用Protparam工具预测牦牛AQP4基因编码蛋白质的基本理化性质，发现该蛋白分子量约为34.69 kD，理论等电点为7.59。含有20种基本氨基酸，其中含量最高的是Gly（10.5%），含量最低的分别是Gln（2.2% ）、Trp（2.2% ）和Cys（2.2%）；含有带负电荷的残基18个，带正电荷的残基33个，其280 nm的摩尔消光系数为49 430 mol/cm，该蛋白的平均亲水系数为0.433。此外，牦牛AQP4基因编码蛋白中含有8个Cys（图4）。

2.4.2 牦牛AQP4蛋白的亲水性/疏水性 运用ProtScale工具对牦牛AQP4进行亲水性和疏水性分析。依据氨基酸分值越低亲水性越强和分值越高疏水性越强的规律可知，牦牛AQP4基因编码蛋白多肽链第136位Ala具有最低的分值-3.156和最强的亲水性；第14位Leu具有最高的分值1.978和最强的疏水性。多肽链整体表现为疏水性（图5），此结果与DNAMAN软件分析结果基本一致。

图5 牦牛AQP4蛋白疏水性分析

2.4.3 牦牛AQP4蛋白的跨膜区分析 如图6所示，牦牛的AQP4为6个跨膜螺旋结构蛋白。其中，1-37位氨基酸为胞内部分，38-60氨基酸为第1个跨膜螺旋，61-69氨基酸在胞外，70-92氨基酸为第2个跨膜螺旋，93-111为胞内部分，112-134为第3个跨膜螺旋，135-153为胞外部分，154-176为第4个跨膜螺旋，177-188为胞内部分，189-211为第5个跨膜螺旋，212-230为胞外部分，231-253为第6个跨膜螺旋，254-332为胞内部分。

图6 牦牛AQP4蛋白跨膜区域分析

2.4.4 牦牛AQP4蛋白的高级结构预测 采用SWISS-MODEL对牦牛AQP4蛋白同源建模获得三级结构模型，该结果表明牦牛AQP4蛋白主要由α-螺旋、延伸和无规则卷曲构成，这与二级结构预测结果（图7，图8）一致。此外还发现牦牛AQP4由相同的4个亚基组成的同源四聚体，每个亚基均由完全相同的322个氨基酸组成。

图7 牦牛AQP4蛋白的二级结构预测

图8 牦牛AQP4蛋白三级结构预测

2.4.5 牦牛AQP4蛋白同源性及系统发育分析 通过NCBI数据库中收集下载6个物种AQP4蛋白的序列，采用MegAlign软件进行同源性分析，发现牦牛AQP4蛋白与其它物种AQP4蛋白具有较高的同源性，均在90%以上，牦牛与黄牛AQP4氨基酸序列间同源性最高（表1），为98.8%。与绵羊、野猪、人、狼犬、小家鼠分别为97.9%、96.1%、94.6%、92.5%、92.0%。用NJ法构建了7个物种的AQP4基因系统发育树（图9）。结果表明，牦牛与黄牛、绵羊在系统发育树中距离最近，这与动物学分类结果细胞水肿的“最后共同通道”。根据AQP4敲除鼠试验病理模型研究表明AQP4在脑水肿的形成与去除的作用是双方面的［14］。在低氧处理大鼠星形胶质细胞模拟低氧脑缺血的模型中，相比于AQP4敲除型星形胶质细胞，野生型细胞会更快速的肿胀，肿胀后细胞体积比AQP4敲除细胞更大，提示AQP4在促进水分进入星形胶质细胞中起着重要作用［15］。另外，复氧后发现野生型星形胶质细胞的肿胀程度仍然是AQP4敲除型的1.3倍，表明AQP4可以加速低氧处理后星形胶质细胞水肿的清除［15］。

图9 NJ法构建的AQP4基因系统发生树

表1 牦牛与6个物种AQP4蛋白氨基酸序列同源性（%）比较

本研究克隆得到的牦牛AQP4基因编码区序列具有特异的起始密码子（ATG）和终止密码子（TGA），是牦牛AQP4基因编码区全长序列，编码AQP4蛋白。牦牛AQP4基因含有一个长度为966 bp的开放阅读框，编码322个氨基酸，整条多肽链表现为疏水性。由此推测，牦牛的该区域适益于水分子包裹的环境中。通过对牦牛AQP4基因编码氨基酸序列跨膜结构进行分析表明，牦牛AQP4蛋白为6次跨膜螺旋结构蛋白，且这些跨膜区富含α-螺旋，缺少β-折叠结构，这与水通道蛋白家族其它成员结构相似［16］。该蛋白具有水通道蛋白家族保守的序列特征，其二级结构主要由α-螺旋、延伸和无规则卷曲构成，基本一致。

3 讨论

近年的研究表明，脑水肿是缺血缺氧性损伤最常见的病理现象。了解水分子在细胞内外或跨血脑屏障运输的机制对于研究脑水肿具有重要意义。水通道蛋白被认为是对脑中水运动提供关键路径的主要水通道［10-13］，其中AQP4是在水通道蛋白家族中在脑中表达最为丰富的一个亚型，也被认为是产生这与其它AQPs结构相似［16］。此外，我们还发现牦牛AQP4基因编码氨基酸序列中含有两个天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（Asn-Pro-Ala，NPA）结构，NPA为AQP家族共有的特征结构。这与Preston等［16］发现的结果相一致，且这两个NPA序列在空间上围绕通道中轴呈点对称分布。该蛋白序列中存在8个Cys。根据徐国恒等［17］研究结果推测Cys残基的巯基基团发生氧化可形成二硫键，而疏水性氨基酸残基围绕着二硫键可形成局部疏水中心从而阻止水分子进行肽的内部破坏氢键，该结构特征对于维持其结构稳定及功能行使具有重要意义。同源建模结果表明牦牛AQP4蛋白高级结构是由相同的4个亚基组成的同源四聚体，这与鼠中AQP4蛋白高级结构类似［18］。每个四聚体都含有4个向外伸长围绕中心孔隙排列的结构域，分别代表4个水孔，具有独立的水通透活性。该四聚体在膜上的组装是维持AQP稳定性及正常功能所必需的。此外，序列同源性在一定程度上反映物种间亲缘关系的远近。通过序列比对和系统进化分析发现，牦牛AQP4蛋白与其它物种AQP4蛋白具有较高的同源性，这与物种进化的结果相一致，表明AQP4基因可能是由同一个祖先基因进化而来，同时也反映了AQP4蛋白在不同物种结构上的稳定性对生物体的功能重要性。我们还发现牦牛和黄牛AQP4基因编码氨基酸序列间同源性最高，说明牦牛AQP4基因与黄牛该基因功能也极为相似，同时也提示了牦牛在适应高原低氧极端环境的过程中，AQP4基因在牦牛和黄牛体内的表达量可能存在着一定差异。

4 结论

本研究利用分子克隆手段获得牦牛AQP4基因的编码区序列，并首次通过生物信息学相关技术和方法发现该蛋白含有6次跨膜结构，属于疏水性蛋白；二级结构由α-螺旋、延伸、β-折叠及无规则卷曲构成；牦牛AQP4蛋白与黄牛、绵羊等物种间同源性较高。

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（责任编辑 李楠）

Cloning and Bioinformatics Analysis of the CDS of Yak AQP4 Gene

Liu Jianfeng1Ding Yanping2Hou Boru3Wang Jianlin1Shao Baoping1
（1. School of Life Science，Lanzhou University，Lanzhou 730000；2. College of Life Sciences of Northwest Normal University，Lanzhou 730070；3. The Second Clinical Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730030）

A coding region sequence of yak AQP4 was cloned by molecular cloning technique. Some characters of the AQP4 gene and encoded protein sequences were predicted and analyzed by the methods of bioinformatics in the following aspects as the general physical and chemical properties， hydrophobicity， transmembrane structure and secondary structure. Results showed that the full-length of yak AQP4 contains a complete ORF（966 bp） encoding 322 amino acid. The putative molecular weight and theory isoelectric point of AQP4 gene in yak were 34.69 kD and 7.59， respectively. The protein encoded by yak AQP4 contains six transmembrane α-helices， and it is a hydrophobic protein. The second structures are mainly composed of α-helix， extended strand and random coil. Deduced amino acid sequences of AQP4 gene between yak and Bos Taurus， Ovis aries， Susscrofa and other species were high on homology and the phylogenetic distance consistent with their genetic relationship.

yak；Aquaporin 4（AQP4）；gene；CDS region；molecular cloning；bioinformatics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.019

2014-07-03

国家自然科学基金青年科学基金项目（31000190），兰州大学中央高校基本科研业务费专项

刘健锋，男，硕士研究生，研究方向：分子生物学；E-mail：andyandhope@gmail.com

邵宝平，男，博士，副教授，硕士生导师；研究方向：高原动物适应性机理；E-mail：shaobp@lzu.edu.cn