产毒真菌基因组研究进展

王龑刘阳刘伊宁

（1. 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；2. 农业部农产品加工重点实验室，北京 100193）

产毒真菌基因组研究进展

王龑1，2刘阳1，2刘伊宁1

（1. 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；2. 农业部农产品加工重点实验室，北京 100193）

真菌毒素是产毒真菌产生的次生代谢产物，以木霉、曲霉、毛霉、青霉和根霉为主的丝状真菌是农产品中常见的产毒真菌。阐明农产品中产毒致病微生物的基因组序列信息是揭示真菌特殊遗传性状的基础。截至2013年12月，共有子囊菌门中204个种和担子菌门中62个种的基因组序列已经测序或公布，它们的基因组大小大部分在30-40 Mb。整理了部分已完成基因组测序的具有产毒能力或致病力的真菌基因组信息，并对真菌测序方案、主要产毒真菌及其比较基因组学的研究进展进行了综述。

真菌；真菌毒素；农产品；基因组；比较基因组学

真菌毒素是天然产生的毒素，主要包括黄曲霉毒素、镰刀菌毒素、赭曲霉毒素、棒曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等，真菌毒素能够污染几乎所有种类的食用和饲用农产品，在我国，小麦、玉米、稻谷、花生等粮油产品受真菌毒素污染情况严重，此外，奶制品、坚果、干果、香辛料、水果等食品也易受到污染［1］。由于真菌毒素具有强毒性和致癌性，对人类和动物健康造成了巨大的威胁［2］。农产品中真菌毒素污染问题已成为世界各国高度关注的食品安全热点。因此，合理控制和预防产毒真菌对于保障农产品安全具有重要意义。真菌基因组的阐明将为真菌特性的分析提供强有力的依据，为揭示真菌特殊性状的遗传基础和分子机理奠定基础。对于深入解析种植、生长、运输、储藏过程中产毒真菌菌群的发生和形成，真菌毒素的合成路径及其调控机制、产毒真菌与农产品互作、危害储粮品质的机理具有深远的实际意义。

最近10年来真菌基因组学研究发生根本性的变化，真菌已成为真核生物基因组研究的最佳模式生物。本研究整理了部分已完成基因组序列测定的具有产毒能力真菌的信息，并对真菌测序方案、真菌毒素主要产毒菌及其比较基因组学的研究进展进行了综述。

1 基因组研究技术进展

真菌多样性丰富，基因组具有相对较小、重复序列高、易于突变等特点，因此，真菌基因组的测序研究是很有必要的。通过真菌基因组学的研究可以了解真菌各种代谢过程、遗传机制和生命活动所需要的基本条件，以及微生物特殊功能如致病性的遗传基础等［3，4］。

真菌基因组测序分为基因组从头测序（De novo）和基因组重测序（Genome re-sequencing）。基因组从头测序是指不需要任何现有的序列资料就可以对某个微生物物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼装，从而获得该真菌的基因组图谱［5］。基因组重测序是对基因组序列已知的真菌进行基因组测序，并在个体水平或群体水平进行差异性分析的方法。真菌基因组重测序能够检测全基因组的罕见变异。

随着科学技术的发展，目前测序技术已经发展到第三代。第一代Sanger测序法，基本原理是基因组DNA经酶切后的片段亚克隆至2 kb 的小文库和10-20 kb 的大文库中。从两端开始对克隆进行测序（即正义链和负义链），然后组装成连续的叠连群（Contigs），最终形成完整的基因组［5］。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis），即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，在Sanger测序方法的基础上，用不同颜色的荧光标记4种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/ Solexa Genome Analyzer和 Applied Biosystems SOLID system［6］。这3个技术平台各有优点，454FLX的测序片段比较长，高质量的读长（Read）能达到400 bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于99.94%，而在15×覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代测序技术中准确度最高的。第三代基因测序技术即基于纳米孔的单分子读取技术。荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。单分子的DNA聚合酶被固定在直径只有几十纳米的纳米孔内，当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，即荧光基团被DNA聚合酶切除为止［5，7］。第三代测序技术主要有3个优势：一是实现了DNA聚合酶自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍；二是实现了DNA聚合酶自身的延续性，一个反应就可以测非常长的序列，读长达几千个碱基；三是测序精度非常高，达到99.9999%。此外，第三代测序可以直接测RNA的序列，大大降低体外逆转录产生的系统误差；可以直接测甲基化的DNA序列，通过DNA聚合酶复制碱基时停顿的时间不同，判断模板的C碱基是否甲基化［7］。

2 常见重要致病真菌基因组信息

随着测序技术的发展和测序服务的普及，大量真菌基因组陆续完成测序和注释，截止到2013年12月，在NCBI基因组数据库中共有子囊菌门（Ascomycota）中204个种的基因组序列和担子菌门（Basidiomycete）中62个种的基因组序列已经公布。子囊菌门中公布的基因组序列包括盘菌亚门（Pezizomycotina）的145个种和酵母亚门（Saccharomycotina）的59个种。

最早完成测序的种属一般都是具有某一生物学功能并用于工业化生产的。真菌的基因组测序工作是从酵母开始的，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、 粟 酒 裂 殖 酵 母（Schizosaccharomyces pombe）是食品工业的常见菌，用于面包、酒类生产；粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）是生物学研究的模式菌株，分别在1965年、1997年、2002年和2003年测序完成［8-10］。米曲霉（Aspergillus orzaye）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的全基因组序列于2005 年完成测序和注释［11，12］。黑曲霉（Aspergillus niger）、 棒 曲 霉（Aspergillus clavatus）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）和土曲霉（Aspergillus terreus）等丝状真菌基因组序列也相继完成测序和/或注释［4，13］。除曲霉属外，产黄青霉（Penicillium chrysogenum）和链格孢菌（Alternaria brassicicola）的基因组也陆续完成测序［14］。表1 列出了已经完成的一些农产品中常见致病真菌的基因组测序、注释的相关信息［8-10］。这些真菌的基因组大小大部分为 30-40 Mb，进一步进行比较基因组学研究，将有助于了解真菌的生物特性，解决农业、工业和医学等领域的重大问题。

表1 农产品中常见致病真菌的基因组信息

3 部分完成全基因组序列测定的真菌

3.1 曲霉菌（Aspergillus）

曲霉菌属于子囊菌门（Ascomycota）盘菌亚门（Pezizomycotina），目前测序研究的主要有曲霉属9个种。棒曲霉生长在土壤、霉果皮、动物粪等基物上，产生可能使人类和动物致病的棒曲霉素（Patulin）；黄曲霉感染花生、玉米等谷物，产生高致癌的黄曲霉素（Aflatoxin）威胁人畜类健康；烟曲霉感染玉米和豆粕等谷物，是临床上重要的条件致病真菌，过敏体质者、器官移植患者及免疫缺陷患者等更易感染；米曲霉产生蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶和植酸酶等复合酶，是生产在大肠杆菌中不能表达的真核生物活性蛋白的理想载体；黑曲霉用于工业生产柠檬酸、药品、酶和食品，大部分菌株都产生有机酸和水解酶，部分菌株具有致病力，产生赭曲霉毒素（Ochratoxin）；白曲霉用于酿造烧酒，白曲霉生长在蒸熟的谷物培养基上，分泌多聚糖水解酶，把谷物中的淀粉物质转化成糖类，与黑曲霉不同，白曲霉不产生赭曲霉毒素；构巢曲霉能诱导产生异核体或二倍体、有性和无性孢子，是遗传学和生物化学研究的模式生物之一；土曲霉产生的次生代谢产物——他汀（Lovastatin），临床上被广泛应用于心脏病预防。这些曲霉近缘种的基因组大约为30-37 Mb，分布于5或8条染色体。

3.1.1 黄曲霉 黄曲霉菌是一种自然界中常见霉菌，其严重威胁人畜健康。黄曲霉普遍存在于花生、玉米或黄豆中，对作物造成严重霉害；同时会产生高致癌、致畸毒性的黄曲霉素（Aflatoxin）。黄曲霉素主要有B1、B2、G1、G2，以及另外两种代谢产物M1、M2。其中AFB1是最危险的致癌物，在玉米、花生、棉花种子以及一些干果中常被检测到。黄曲霉为单倍体，产生无性孢子，基因组约36 Mb，分布于8条染色体。

3.1.2 烟曲霉 烟曲霉在潮湿环境中普遍存在，可侵染棉铃和苹果等，引起果实腐烂，或寄藏于种子上，造成农产品单位产量和质量的下降，造成巨大的经济损失。由于烟曲霉作为重要的人类致病菌，烟曲霉的基因组2005年被测序完成，在最近12年中烟曲霉导致的疾病发生率增加了14倍，尤其是过敏体质者、器官移植患者、艾滋病毒携带者、艾滋病患者、慢性肉芽肿病及重症联合免疫缺陷等患者更易感染。烟曲霉对其他哺乳动物也产生致病性，研究表明烟曲霉可以导致鸟类肺部和气囊感染。基因组测序分析将有助于理解烟曲霉的生物学特性，识别烟曲霉致病性的分子机制。烟曲霉基因组约30 Mb，分布于8个染色体，可能有9 900-11 000个基因。

3.1.3 棒曲霉 棒曲霉可生长在土壤、果皮、动物粪便等基质物上，能够产生使人类和动物畸变、癌变的棒曲霉素（Patulin）。目前这种毒素在果品、蔬菜、果蔬汁、果酒等食品中均有被发现，并引起世界各卫生组织极大的关注。棒曲霉与烟曲霉、土曲霉这两大病原真菌亲缘关系较近。棒曲霉为单倍体，基因组约28 Mb，分布于 5条染色体，大约有9 323个基因。

3.1.4 构巢曲霉 构巢曲霉也称为小巢状曲菌（Emericella nidulans），通常为单倍体，但能诱导为异核体或二倍体，产生有性和无性孢子，而其他大部分曲霉是无性的。构巢曲霉菌属于同宗配合菌，即任何两个菌株间均可直接进行交配产生子囊孢子。目前构巢曲霉是遗传学和生物化学上研究得最广泛的生物之一，已经得到了数百个基因的突变株。构巢曲霉也是研究细胞生物学的模式生物之一，它还用来表达哺乳动物基因。构巢曲霉中的乙醇脱氢酶基因lacA可调控启动子，能够被乙醇诱导表达，同时又能被葡萄糖抑制，是基因表达调控中重要的工具元件。研究构巢曲霉基因组将有助于了解构巢曲霉的生物学特性，与寄主的相互作用以及曲霉菌的致病性，还能促进疫苗和药物的研制开发。构巢曲霉与黑曲霉、米曲霉、黄曲霉和烟曲霉等亲缘关系较近。构巢曲霉基因组约31 Mb，分布于8条染色体，含11 000-12 000个基因。

3.1.5 黑曲霉 黑曲霉用于工业生产柠檬酸、药品、酶和食品。黑曲霉具有表型多样性，在全球均有发现，包括海洋和陆地菌株，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，大部分菌株都产生有机酸和水解酶，有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯，部分菌株具有致病力，产生赭曲霉毒素（Ochratoxin）。生长适温37℃，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变。黑曲霉基因组约34 Mb，分布于8条染色体，含10 947个基因。

3.1.6 白曲霉（Aspergillus kawachii） 白曲霉用于酿造烧酒，是日本传统的蒸馏酒，原料主要包括大米、大麦、番薯、马铃薯和荞麦。在生产烧酒的过程中，白曲霉生长在蒸熟的谷物培养基上，分泌的酶包括各种多聚糖水解酶，把谷物中的淀粉物质转化成糖类。白曲霉与黑曲霉在进化上亲缘关系最近，在食品生产工业上使用，能够产生大量的柠檬酸防止细菌污染。但是，与黑曲霉不同，不产生赭曲霉毒素。白曲霉基因组大小约36.5 Mb，含有11 475个基因。

3.1.7 土曲霉 丝状真菌土曲霉能够产生次生代谢产物他汀。在过去10年中，他汀类降胆固醇药物在临床上被广泛应用于心脏病预防。目前应用的5个他汀类药物中，土曲霉能发酵产生其中3个：普伐他汀（Pravastatin），辛伐他汀（Simvastatin）和洛伐他汀（Lovastatin）。此外，土曲霉也能产生对人类和其他动物有害的棒曲霉素（Patulin）和橘霉素（Citrinin）。土曲霉是单倍体，基因组大约35 Mb，分布于 8条染色体，可能含有996个基因。

3.2 灰葡萄孢霉（Botryotinia fuckeliana）

灰葡萄孢霉是一种植物致病菌，可引起灰霉腐败（Gray mold rot）或灰霉病（Botrytis blight），感染超过200种植物，包括大部分的蔬菜、水果、多种乔木、灌木、花卉和杂草。灰葡萄孢霉在全球造成的农作物损失占全部损失的20%，每年约有10-100亿欧元。在特定环境下，灰葡萄孢霉可造成葡萄贵腐（Noble rot），这是酿造贵腐酒等餐后甜酒必需的。灰葡萄孢霉是丝状真菌单倍体，基因组约38 Mb，分布于30个染色体，可能有11 000-17 000个基因。

3.3 链格孢菌（Alternaria brassicicola）

链格孢菌是无性生殖有丝真菌，在芸苔属植物上引起黑斑病，包括花椰菜、甘蓝、油菜和芥菜上均会发病，侵害叶、茎、荚。叶片染病病斑圆形至椭圆形，黑褐色，大小2-5 mm，具同心轮纹，湿度大时，病部生有黑灰色霉状物，即病原菌分生孢子梗和分生孢子。病菌以菌丝体或分生孢子在病残体或留种株上越冬，也可以分生孢子附着在种子表面越冬，翌年以分生孢子进行初侵染和再侵染，借气流传播致病，一般发生在农作物的夏季生长期。在采后油菜作物上因为链格孢菌引起的损失达60%以上。链格孢菌基因组约29.6 Mb，分布于9条染色体。

3.4 镰刀菌

3.4.1 轮状镰刀霉菌（Fusarium verticillioides） 轮状镰刀霉菌又称为串珠状赤霉（Gibberella moniliformis），是全球性感染玉米的真菌。一定的环境条件，串珠镰刀菌使玉米内核和穗腐烂，导致农作物重大的经济损失。串珠状赤霉也产生致癌物伏马菌素（Fumonisin mycotoxins）。如果食用了含伏马菌素的玉米可引起人类和动物多种疾病。串珠状赤霉是单倍体，基因组约46 Mb，分布于11条染色体，可能含有16 000个基因。

3.4.2 禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum） 禾谷镰刀菌又称为玉蜀黍赤霉（Gibberella zeae），是小麦和大麦赤霉病的病原体。我国每年小麦赤霉病受害面积在4 00×104hm2以上，重发区已经由长江中下游向北扩展到山东、河南、河北等小麦主产区，2010年发病面积甚至超过约0.667×108hm2，给小麦生产造成巨大损失，严重影响籽粒品质。镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol）严重威胁食品安全。DON毒素具有很强的细胞毒性和胚胎毒性，能引起人类食管癌、IgA肾病、克山病和大骨节病等。玉蜀黍赤霉还产生对人类及动物健康造成严重危害的呕吐毒素（Vomitoxin）。玉蜀黍赤霉基因组约40 Mb，分布于4条染色体，可能有11 000-14 000个基因。

3.5 青霉（Penicillium）

3.5.1 指状青霉（Penicillium digitatum） 指状青霉是一种腐生真菌，是橘科水果采后重要的致病菌，能引起柑橘类绿霉病（Citrus green mould），世界范围内90%的橘类水果损失是由指状青霉引起的。指状青霉的基因组测序有助于阐释致病机制的遗传基础和高度的宿主特异性，检测刺激代谢物基因簇，包括吲哚二萜，棒曲霉素钙激活钾通道阻断剂。指状青霉基因组约26 Mb，大约含有9 000个基因。

3.5.2 产黄青霉（Penicillium chrysogenum） 产黄青霉也称为点青霉，是无性丝状真菌，至今60年来一直用于生产青霉素，普遍的细菌类抗生素，是青霉素V和青霉素G商业的主要来源。菌株训化用于提高青霉素的产量，主要是扩大基因组上产生青霉素的基因簇片段，目前青霉素的生物合成基因已经被清楚的鉴定注释了。产黄青霉是单倍体，基因组约34.1 Mb，分布于4条染色体，可能有11 000-12 000个基因。

3.6 稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）

稻瘟病菌无性型称Pyricularia grisea，是单倍体丝状菌，是稻瘟病的病原体。稻瘟病是一种世界性水稻病害，每年因此病害损失的粮食可供养6 000万人。由于水稻产量增加，近年来因稻瘟病造成的损失日益加大。虽然抗稻瘟病的水稻已经研究出来，但稻瘟病菌可迅速产生抗性。除了水稻，某些稻瘟病菌还可感染大麦、小麦、珍珠粟和草坪。稻瘟病菌是一种理想的研究植物病原真菌和宿主相互作用的模式生物。稻瘟病菌基因组约40 Mb，分布于7条染色体。

3.7 粗糙脉孢菌

粗糙脉孢菌属于子囊菌亚门脉孢菌属（Neurospora），是一种多细胞丝状真菌，是20世纪现代遗传学和分子生物学研究的模式物种。1941年Beadle和Tatum 两位科学家通过X射线诱导处理粗糙脉孢菌，获得了大量的营养缺陷突变体，在对这些突变体研究分析以后，提出了一个基因对应一种酶的假说。粗糙脉孢菌是单倍体雌雄异体子囊菌，仅能识别蓝光/紫外光范围，子囊孢子减数分裂产物的有序重排有利于基因重组分析。粗糙脉孢菌基因组约有40 Mb，分布于7条染色体。

3.8 颖枯壳针孢（Phaeosphaeria nodorum）

颖枯壳针孢无性型称Stagonospora nodorum，属于子囊菌半知菌亚门（Deuteromycotina），分生孢子器散生，是小麦的主要病害，主要为害小麦未成熟穗部和茎秆，也为害叶片和叶鞘，引起有重大经济损害的禾草壳针孢叶斑病，也称为小麦颖枯病。病害多发生于潮湿阴冷的气候，多雨年份和潮湿地区发生尤其严重。颖枯壳针孢菌基因组约30 Mb，分布于24条染色体。

3.9 核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）

核盘菌属于子囊菌亚门核盘菌属（Sclerotinia），是已知具有最广泛宿主的真菌病原体，危害作物和蔬菜，它引起如菜豆菌核病（White mold of bean），向日葵烂盘型菌核病（Head rot of sunflower），油菜菌核病（White mold of canola）和大豆菌核病（Sclerotinia stem rot of soybean）。核盘菌是研究寄主-病原物相互作用的模型。核盘菌是单倍体，基因组38 Mb，分布于3条染色体。

3.10 里氏木霉（Trichoderma reesei）

丝状真菌里氏木霉是多细胞的真核微生物，属于半知菌亚门木霉属（Trichoderm），其作为工业菌株用于分解不同植物材料的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等。里氏木霉对人体无毒性，在产酶条件下也不产生真菌毒素和抗生素，适合用于工业生产蛋白酶类。里氏木霉是单倍体，基因组33 Mb，分布于7条染色体。

3.11 禾柄锈菌（Puccinia graminis）

禾柄锈菌属于担子菌门，引起谷类作物，如小麦、燕麦、黑麦、大麦等的秆锈病。秆锈病，也称为黑锈或秆黑锈病，是世界上最具破坏性的禾谷类作物病害。禾柄锈菌具有复杂的生命周期，包括5个孢子阶段和两个非常不同的宿主，即以杂草为初宿主，通常以小蘖属植物为转换寄主。因为初寄主专一性，禾柄锈菌有很多专化型，如Puccinia graminis f. sp.tritici可侵染小麦。禾柄锈菌为单倍体，基因组约80 Mb，分布于18条染色体。

3.12 玉米瘤黑粉菌（Ustilago maydis）

玉米瘤黑粉菌是一种担子菌，通常以一种丝状菌丝体存在，异宗配合。常为害玉米叶、秆、雄穗和果穗等部位的幼嫩组织，产生大小不一的病瘤，是我国玉米上分布最广的主要病害之一，北方发生较为普遍而严重。在玉米瘤黑粉菌的生活史中，有两种不同形态的细胞，即单倍体细胞（担孢子）和双核菌丝体。单倍体细胞没有致病性，在特定培养基上芽殖产生“酵母”状菌落。不同遗传型的单倍体细胞融合形成双核菌丝，双核菌丝能在寄主植物体内迅速发育，刺激寄主组织形成肿瘤，并继而经过细胞核融合，产生双倍体的冬孢子。玉米瘤黑粉菌基因组约20 Mb，分布于23条染色体。

4 真菌基因组研究的应用及未来

比较基因组学（Comparative genomics）在对未知生物的基因组图谱和测序基础上，与已知基因和基因组结构进行比较，通过序列同源比对和计算机分析从而了解基因的功能、表达机理和物种进化。随着已测序基因组数量的不断增加，一方面，比较基因组学应用于基因鉴别及基因表达的调控元件的研究［15］；另一方面，比较基因组学能够帮助鉴定亲缘关系较近的物种之间的区别，包括致病性、次级代谢模式或其他特性［13，16，17］。大量预测到的微生物代谢物的生物合成基因所反映的不是标准的发酵条件下产生的，特殊条件下会激活这些基因。这些隐藏的基因簇大多编码一些重要致病因子的生物合成，如毒素、药物等，随着高通量筛选平台的发展，一些小分子在生物系统上的功能逐渐显现出来。基因组挖掘和宏基因组分析技术，与相关基因分析工具组合分析大的生物合成基因簇，在异源源系中高效克隆表达，揭开棘手的或神秘的化合物的面纱，这个跨学科的研究领域已经打开了天然产物发现的新时代［18，19］。

基因组测序使得真菌次级代谢产物合成基因的鉴定快速发展，在丝状真菌中，代谢相关基因一般是以基因簇（Genes clusters）的形式分布，经过基因组注释后，在曲霉属真菌中至少发现了30-40个典型基因簇存在，这些基因簇一般与聚酮体或非核糖体多肽的合成相关。基于海量信息和比较基因组学的基因组采矿技术（Genome mining）能够挖掘和鉴别一些真菌基因组中未知蛋白功能，在模式微生物构巢曲霉基因组隐藏的代谢途径中分析发现了新的聚酮合酶-非核糖体肽合酶（PKS-NRPS）混合代谢物［3，20］。黑曲霉基因组数据经过精确的比对分析并结合代谢网络的重构鉴定出了许多与DNA 复制、物质转运和胞内/胞外酶生产相关的蛋白，丰富了黑曲霉发酵产柠檬酸的分子机制，同时预测出伏马菌素和赭曲霉毒素A（OTA）合成的基因簇信息［4］。比较基因组学技术分析烟曲霉和米曲霉，提高了功能注释和代谢途径的模拟分析，分析表明3个物种间存在超过500个非编码区域是保守的，为真菌基因组进化和基因调控研究提供新的理解［13］。

真菌毒素合成主要通过聚酮代谢PKS（Polyketide synthase）、NRPS非核糖体多肽合成（Nonribosomal peptide synthetase）、PKS-NRPS混合代谢、萜类化合物代谢、氨基酸相关代谢。PKS和NRPSs在大多数真菌基因组中都存在，导致了许多次生代谢物的物种多样性，通常参与生物合成同一种代谢产物的基因位于同一个基因簇［21］。在克隆了几个重要的黄曲霉毒素合成基因之后，黄曲霉毒素合成基因簇在黄曲霉和寄生曲霉中被发现［22］，有30个基因参与黄曲霉毒素的生物合成，黄曲霉毒素合成基因集中位于三号染色体大约75 kb的区域内，离端粒大约80 kb。碳黑曲霉（Aspergillus carbonarius）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）和疣状青霉（Penicillium verrucosum）都能够产生OTA，有研究认为PKS参与OTA合成的第一步，催化合成OTA的主体结构异香豆素。进化树分析6个已知产OTA 菌株的PKSs序列的KS和AT结构域，证实不同真菌OTA PKS酶结构和进化的多样性，KS和AT结构域被认为是PKS的保守区域，参与OTA的合成。Chiang等［3］采用基因组采矿技术结合代谢组学分析揭示了构巢曲霉中一个含有两个真菌聚酮合酶的基因簇编码一个聚酮化合物。经过比较基因组分析，在不同物种间仅有一小部分鉴定到的基因簇是保守的［23］。Callaghan等［24］采用基因组步移技术和序列比对分析，鉴定到在疣状青霉上存在PKS基因，且与红曲霉橘毒素合成基因簇同源性最高，在PKS上下游亦存在氧化还原蛋白和转运蛋白，参与疣状青霉OTA的合成。Atoui等［25］分析了9个赭曲霉和5个炭黑曲霉的KS结构域序列，结果表明KS结构域分布在5个不同的基因簇上，表明PKS基因具有不同的生物学功能。

Bhatnagar等［26］以解决黄曲霉毒素污染为例，综述了采用基因组、蛋白组和代谢组的方法挖掘有用的信息，形成有效的战略揭示真菌产生真菌毒素的机制，有助于开发具有真菌抗性的作物，减少作物的真菌毒素污染。Yu等［27］构建黄曲霉菌丝cDNA表达文库，采用表达序列标签（ESTs）技术分析营养和环境条件对黄曲霉毒素合成的影响，从7 218个表达序列中鉴定到110个序列影响黄曲霉毒素的合成。2011年，Yu等［28］采用RNA-Seq技术对不同温度条件下黄曲霉转录组分析研究，表明在适合黄曲霉生长的37℃和适合黄曲霉产生黄曲霉毒素的30℃，存在1 153个差异表达基因，在30℃条件下30个黄曲霉毒素生物合成基因转录本的表达丰度是37℃条件下的3 300倍，鉴定到两个温度对毒素的负调控因子aflR和aflS。

大量真菌基因组陆续完成测序和注释，产毒真菌的后基因组时代已经开启，研究真菌基因组有助于人们理解不同生长环境下真菌的生理特性、形态差异、进化和代谢多样性。后基因组学的研究，对于深入解析种植、生长、运输、储藏过程中产毒真菌菌群的发生和形成，真菌毒素的合成路径及其调控机制、产毒真菌与农产品互作、危害储粮品质的机理提供新的思路。

［1］Bennett JWKM. Mycotoxins［J］. Clin Microbiol Rev， 2003， 16：497-516.

［2］Hussein HS， Brasel JM. Toxicity， metabolism， and impact of mycotoxins on humans and animals［J］. Toxicology， 2001， 167：101-134.

［3］Chiang YM， Szewczyk E， Davidson AD， et al. A gene cluster containing two fungal polyketide synthases encodes the biosynthetic pathway for apolyketide， asperfuranone， in Aspergillus nidulans［J］. Journal of the American Chemical Society， 2009，131：2965-2970.

［4］Pel HJ， De Winde JH， Archer DB， et al. Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88［J］. Nature Biotechnology， 2007， 25：221-231.

［5］孙健冬， 高通量测序技术在农作物全基因组序列测定中的应用概览［J］. 生物技术进展， 2012， 2（1）：11-15.

［6］王龑， 许文涛， 赵维薇， 等. 组学技术及其在食品科学中应用的研究进展［J］. 生物技术通报， 2011（11）：005.

［7］刘岩， 吴秉铨. 第三代测序技术：单分子即时测序［J］. 中华病理学杂志， 2011， 40（10）：718-720.

［8］Galagan JE， Calvo SE， Borkovich KA， et al. The genome sequence of the filamentous fungus Neurospora crassa［J］. Nature， 2003， 422：859-868.

［9］Wood V， Gwilliam R， Rajandream MA， et al. The genome sequence of Schizosaccharomyces pombe［J］. Nature， 2002， 415：871-880.

［10］余知和， 高元钢， 曾昭清， 等. 真菌基因组学研究进展［J］.菌物学报， 2008， 27（5）：778-787.

［11］Nierman WC， Pain A， Anderson MJ， et al. Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus［J］. Nature， 2005， 438：1151-1156.

［12］Machida M， Asai K， Sano M， et al. Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae［J］. Nature， 2005， 438：1157-1161.

［13］Galagan JE， Calvo SE， Cuomo C， et al. Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with A. fumigatus and A. oryzae［J］. Nature， 2005， 438：1105-1115.

［14］Van den Berg MA， Albang R， Albermann K， et al. Genome sequencing and analysis of the filamentous fungus Penicillium chrysogenum［J］. Nature Biotechnology， 2008， 26：1161-1168.

［15］Andersen MR， Salazar MP， Schaap PJ， et al. Comparative genomics of citric-acid-producing Aspergillus niger ATCC 1015 versus enzyme-producing CBS 513.88［J］. Genome Research， 2011，21：885-897.

［16］Ma LJ， Van Der Does HC， Borkovich KA， et al. Comparative genomics reveals mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium［J］. Nature， 2010， 464：367-373.

［17］Fedorova ND， Khaldi N， Joardar VS， et al. Genomic islands in the pathogenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus［J］. Plos Genetics， 2008， 4：e1000046.

［18］Wilkinson B， Micklefield J. Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways［J］. Nature Chemical Biology， 2007， 3：379-386.

［19］ Gross H. Genomic mining-a concept for the discovery of new bioactive natural products［J］. Current Opinion In Drug Discovery & Development， 2009， 12：207-219.

［20］ Bergmann S， Schümann J， Scherlach K， et al. Genomics-driven discovery of PKS-NRPS hybrid metabolites from Aspergillus nidulans［J］. Nature Chemical Biology， 2007， 3：213-217.

［21］ Gallo A， Knox BP， Bruno KS， et al. Identification and characterization of the polyketide synthase involved in ochratoxin A biosynthesis in Aspergillus carbonarius［J］. International Journal of Food Microbiology， 2014， 179：10-17.

［22］ Yu J. Current understanding on aflatoxin biosynthesis and future perspective in reducing aflatoxin contamination［J］. Toxins，2012， 4：1024-1057.

［23］ Brakhage AA， Schroeckh V. Fungal secondary metabolites strategies to activate silent gene clusters［J］. Fungal Genetics and Biology， 2011， 48：15-22.

［24］ O’Callaghan J， Coghlan A， Abbas A， et al. Functionalcharacterization of the polyketide synthase gene required for ochratoxin A biosynthesis in Penicillium verrucosum［J］. International Journal of Food Microbiology， 2013， 161：172-181.

［25］ Atoui A， Phong Dao H， Mathieu F， et al. Amplification and diversity analysis of ketosynthase domains of putative polyketide synthase genes in Aspergillus ochraceus and Aspergillus carbonarius producers of ochratoxin A［J］. Molecular Nutrition & Food Research， 2006， 50：488-493.

［26］ Bhatnagar D， Rajasekaran K， Payne G， et al. The ‘omics’ tools：genomics， proteomics， metabolomics and their potential for solving the aflatoxin contamination problem［J］. World Mycotoxin Journal， 2008， 1：3-12.

［27］ Yu J， Ronning CM， Wilkinson JR， et al. Gene profiling for studying the mechanism of aflatoxin biosynthesis in Aspergillus flavus and A. parasiticus［J］. Food Additives and Contaminants， 2007， 24：1035-1042.

［28］ Yu J， Fedorova ND， Montalbano BG， et al. Tight control of mycotoxin biosynthesis gene expression in Aspergillus flavus by temperature as revealed by RNA-Seq［J］. FEMS Microbiology Letters， 2011， 322：145-149.

（责任编辑 狄艳红）

Advances in Studies on Genomics of Toxogenic Fungi

Wang Yan1，2Liu Yang1，2Liu Yining1
（1. Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193；2. Key Laboratory of Agro-Products Processing，Ministry of Agriculture，Beijing 100193）

Mycotoxins， a group of toxins structurally related to secondary metabolites are produced by some fungal strains. It is mainly produced by filamentous fungi， including Trichoderma， Aspergillus， Chaetomium， Penicillium and Rhizopus， existed in agricultural products. Illustrating the genome sequence information of the pathogenic microorganisms in agricultural products， is essential to reveal fungal specific genetic traits. Until to December 2013， a total of 204 species in Ascomycetes and 62 species in Basidiomycete genomic information had been sequenced or published， genomes size from approximately 30 Mb to 40 Mb. This review here provides an overview of available genomic information of toxin-producing fungal or virulent fungus， summarizes the recent development in genome sequencing strategies and main fungal produced mycotoxin， and proposes the future direction of the comparative genomics research on fungi.

fungi；mycotoxin；agricultural products；genome；comparative genomics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.004

2014-11-02

国家“973”计划项目（2013CB127805），国家公益性行业（农业）科研专项（201203037），科技基础性工作专项（2013FY113400）

王龑，女，博士，助理研究员，研究方向：农产品真菌毒素预防控制；E-mail：wangyan062006@163.com

刘阳，博士，研究员，研究方向：农产品真菌毒素防控和脱毒理论与技术及其应用；E-mail：liuyang01@caas.cn