血液杆菌Haematobacter sp. 细胞脂肪酸测定的影响因素

何蔚荭安明理陈国参贾彬，3吴晓磊王亚南

（1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南省微生物工程重点实验室，郑州 450008；2.北京大学工程学院，北京 100871；3.深圳大学生命科学学院，深圳 518060）

血液杆菌Haematobacter sp. 细胞脂肪酸测定的影响因素

何蔚荭1安明理1陈国参1贾彬1，3吴晓磊2王亚南1

（1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南省微生物工程重点实验室，郑州 450008；2.北京大学工程学院，北京 100871；3.深圳大学生命科学学院，深圳 518060）

应用美国MIDI公司Sherlock MIS系统检测一株归属于血液杆菌属的新菌种Haematobacter sp. HNMC11807的细胞脂肪酸组成，探讨不同培养方法和条件对其细胞脂肪酸组成的影响。采用不同培养条件培养微生物细胞，即不同的培养基组成、固液类型和培养时间；分析比较细胞脂肪酸检测结果存在的差异。同时对比分析仪器专用的两种检测体系，即常规标准和快速标准体系，对样品脂肪酸测定结果的影响。结果发现，细胞脂肪酸组成与其培养条件密切相关，且差异显著。因此，在应用该系统做微生物分类鉴定时，必需严格遵守特定的、统一的培养条件平行进行。

细胞脂肪酸检测；培养基条件；脂肪酸标准品；血液杆菌

微生物细胞的脂肪酸组成与DNA具有高度的同源性，不同属种的微生物具有不同的脂肪酸指纹图谱［1］。Able等［2］（1963年）提出细菌脂肪酸的分析可以应用于细菌的系统分类鉴定；Oyama（1963年）采用气液色谱法（Gas Liquid Chromatography，GLC）应用于微生物细胞脂肪酸的测定。由于GC法可检测成分比浓度在ng（10-9）甚至pg（10-12）含量［3，4］，具有较高的灵敏度，因此，该项检测技术广泛应用于细菌的鉴定和辨别［5］。Sherlock MIS 系统是美国MIDI 公司成功开发的一套自动化分析细胞脂肪酸的微生物鉴定系统，使脂肪酸检测结果更加快捷准确，并且，检测结果可与系统内数据库进行快捷比对分析，以判别微生物细胞的种属。

大量的报道显示，微生物细胞生长过程中，细胞脂肪酸组成呈动态变化，多数报道认为，细胞中不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸组成，随细胞生长环境条件，如温度、pH或各种生长因子存在状况的变化，以及生长期等发生改变［6-9］。为避免培养条件和提取脂肪酸操作过程引起检测结果的波动，提高细胞脂肪酸检测结果应用于分类鉴定的准确性，使测定结果与系统数据库的比对具有严谨的分析意义，MIDI 公司为脂肪酸鉴定系统制定了一套严格的操作规范，从培养基和培养条件的标准化，到细胞脂肪酸提取处理过程的标准化。尽管如此，在实际试验过程中，仍会出现一些与标准要求有偏差的操作［10，11］，比如生长期较长的细胞、固态培养基难以生长的细胞、标准培养基中不生长的细胞等［12］。本研究尝试在一株归属为血液杆菌属的新菌种Haematobacter sp. HNMC11807的鉴定中，采用不同的试验条件和方法对比细胞脂肪酸的检测结果，探讨更为有效的、更具有可比性的细菌脂肪酸的检测方法和条件，旨在为细胞脂肪酸检测体系应用于微生物的系统分类与鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 一株分离自油田采油回注水的微生物菌株，编号HNMC11807（北京大学供试菌株）。依据该菌株细胞16S rDNA序列比对分析结果，应归属于Haematobacter（血液杆菌属）的一个新物种，即Haematobacter sp. HNMC11807。

1.1.2 培养基和试剂

1.1.2.1 细胞培养基 菌株活化和传代培养采用LB培养基（10 g 蛋白胨，5 g 酵母粉，10 g NaCl，1 000 mL H2O，pH7.0；其中有机类试剂采用安琪酵母股份有限公司产品）。脂肪酸测定采用TSB（Tryptone Soy Broth）培养基（北京奥博星生物技术有限公司）和E2216培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）。试验中的TSA培养基为TSB培养基加入琼脂后的固体培养基。

1.1.2.2 脂肪酸提取用试剂 溶液I：45 g NaOH，150 mL甲醇，150 mL超纯水；溶液II：325 mL HCl（6.0 mol/L），275 mL甲醇；溶液III：200 mL己烷，200 mL甲基三丁基乙醚；溶液Ⅳ：10.8 g NaOH，900 mL超纯水。

1.2 方法

1.2.1 细菌细胞脂肪酸的提取［13］按照 MIDI 公司微生物鉴定系统的操作步骤。TSA（TSB加入琼脂）培养基新鲜培养（设定的温度和培养时间）的待测菌株细胞。刮取 20-40 mg 菌体，置于试管，加入 1 mL 溶液Ⅰ，充分振荡后，＞95℃水浴30 min；冰水迅速冷却，加入2 mL 溶液Ⅱ，振荡混匀后80℃水浴10 min；冰水迅速冷却，加入1.25 mL溶液III，上下颠倒10 min，静置分层后，吸取液相上层部分；加入3 mL溶液Ⅳ，上下颠倒5 min，2 000 r/min离心3 min，静置吸取上层液体于GC样品瓶中，4℃放置待测。

1.2.2 脂肪酸成分检测 采用美国 Agilent 6850 N型气相色谱系统，包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器；通过细菌细胞脂肪酸成分进行细菌鉴定的分析软件采用Sherlock MIS4.5（Microbial Identification System） 和LGS4.5（Library Generation Software）（均为美国MIDI公司产品）。在下述气相色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和全细胞脂肪酸待检样本，分析条件为：柱箱温度 170℃起，升至310℃稳定；检测器温度300℃；进样口温度250℃，常规标准压力10 psi，快速标准27.3 psi；载气为氢气（30 mL/min）、尾吹气为氮气（30 mL/min）；进样量为常规标准1 μL，快速标准5 μL。

2 结果

2.1 培养基组成类型对细胞脂肪酸组成的影响

按照MIDI公司脂肪酸测定体系应采用TSA培养基，而该菌株归属的Haematobacter菌属的模式菌株Haematobacter massiliensis（马赛血液杆菌）细胞的脂肪酸测定采用E2216培养基。本试验采用TSA和E2216培养基平行进行菌株HNMC11807细胞培养与脂肪酸提取和检测，分析不同培养基组成对培养细胞的脂肪酸组成影响。结果（表1）显示，细胞中含量最高的长链脂肪酸（18：1 ω7c）差异最显著。数据库比对分析也显示出不同聚类结果，因此，不同培养基成分对细胞脂肪酸组成具有显著影响。

表1 菌株HNMC11807于28℃培养48 h细胞脂肪酸测定结果

2.2 培养基固液类型对细胞脂肪酸组成的影响［14］

按照MIDI公司脂肪酸测定体系应采用固体培养基，培养并获得菌体细胞。但有些微生物细胞适合液体培养，而在固体培养基中生长很差，难以在规定的时间内生长至稳定期、获得足够量的细胞。由于液体培养基比较适合微生物细胞生长过程中的各种生理生化水解反应，更有利于多数微生物细胞的生长繁殖，因此，细胞生长速度在液体培养基中可能高于在固体培养基中，从而造成细胞脂肪酸组成的差异。本试验采用E2216的液体和固体培养基平行进行菌株HNMC11807细胞培养与脂肪酸提取和检测，结果见表2。据资料报道，随着细胞生长过程中，长链脂肪酸的积累逐渐增加，短链脂肪酸则相反［15］。表2显示，液体培养显著高于固体培养细胞的长链脂肪酸含量，这一结果可能与细胞的生长速度有关，即液态培养细胞生长速度较快。

表2 菌株HNMC11807于E2216培养基28℃培养48 h细胞脂肪酸测定结果

2.3 培养时间对细胞脂肪酸组成的影响

已有的研究结果表明，微生物细胞生长初期小分子脂肪酸含量较高，随培养时间延长，大分子脂肪酸逐渐增加并积累，不同生长期的微生物细胞脂肪酸组成呈动态变化。在MIDI系统的标准检测中，为排除培养时间对细胞脂肪酸组成的影响，一般要求培养时间为2 d。本试验为探讨细胞培养时间对细胞脂肪酸组成的影响，采用E2216固体培养基，平行进行菌株HNMC11807细胞48 h和72 h培养与脂肪酸提取和检测。结果（表3）显示，细胞培养时间延长，其细胞长链脂肪酸含量显著增加，与之前学者的研究结果一致。因此，细胞生长期对脂肪酸组成的检测结果有显著的影响，不同培养时间的细胞脂肪酸组成检测结果不具有严格的可比性。

表3 菌株HNMC11807于E2216培养基28℃培养细胞脂肪酸测定结果

2.4 检测器进样量对细胞脂肪酸组成的影响

MIDI公司脂肪酸测定体系设置了两种标准品的检测项，即常规检测标准品和快速检测标准品，两种标准品的脂肪酸组成配置没有显著差别（表4），但在进样量方面，快速检测体系高于常规检测体系5倍；在检测时间方面，快速检测体系柱分析时间低于常规检测体系。由于进样量的增加，快速检测体系可以提高样品的可检测性，对检测结果的影响需探讨确认。本试验将菌株HNMC11807于E2216固体培养基28℃、48 h培养，提取并采用不同的检测体系和标准品检测细胞脂肪酸组成，对比分析两种检测体系的测定，结果（表5）显示，由于进样量的提高，快速检测体系能够检测到更多微量成分（如含量＜1%的脂肪酸）。但是，对比分析具有可比性意义的脂肪酸检测结果（即含量＞1%-5%的脂肪酸），发现快速检测体系与常规检测体系没有显著的差异（表5中黑体标注的脂肪酸），同时数据库给出的比对分析结果也非常一致。因此，在实际检测中两种体系均可以使用，只是跨体系的检测结果比较时存在微小的误差。建议作为新菌种鉴定指标比对分析数据时，最好在相同的检测体系下完成。

表4 2种标准品脂肪酸组成的检测结果

表5 菌株HNMC11807于E2216固体培养基28℃培养48 h细胞脂肪酸测定结果

2.5 不同处理条件对细胞脂肪酸含量影响强度对比

综上可知，不同处理方法对细胞脂肪酸组成有不同程度的影响，针对本试验的菌株Haematobacter sp. HNMC11807的脂肪酸测定结果对比（表6）表明，对细胞脂肪酸影响的幅度分别为细胞培养时间＞液体培养基培养＞不同成分培养基培养＞＞检测体系差别，进一步分析认为，在同一温度条件下，细胞的菌龄是影响细胞脂肪酸组成的关键因素。我们认为，以MIDI分析系统测定的细胞脂肪酸数据为分类学依据时，除了两种标准品应用对检测体系影响较低外，其它不同处理条件的结果间差异非常显著，分析时必需采用完全一致的条件平行培养和处理细胞，否则其脂肪酸检测结果不具有分类学意义上的可比性。

表6 不同处理条件对细胞脂肪酸含量测定结果的影响幅度

3 讨论

通过对归属于血液杆菌属的一个新物种Haematobacter sp. HNMC11807细胞脂肪酸检测分析，探讨了培养基组成、培养基固液类型、培养时间对细胞脂肪酸组成的影响，同时还探讨了两种检测体系获得的细胞脂肪酸检测结果的可比性，发现细胞的生长期对脂肪酸的检测结果影响最为显著。因此，在应用全细胞脂肪酸分析结果进行物种分类鉴定时，需要严格控制细胞生长期；不同培养基类型（组成类型和形态类型）培养的细胞和不同生长期的细胞，其脂肪酸的检测结果不具有可比性，在分类鉴定中不能作为比对分析的依据。在细胞脂肪酸的气相检测中，采用快速检测体系或常规检测体系并不影响结果的正确性，但在微生物分类鉴定时，待鉴定细胞与参比细胞应采用相同的体系检测脂肪酸组成，以确保比对结果分析的可靠性和严谨性。

4 结论

微生物细胞脂肪酸的组成和含量与细胞的生境和生长阶段密切相关。在细胞脂肪酸检测和数据分析中，应重视影响细胞生长速度的各种环境条件和因素（如培养基组成成分、培养基类型和培养温度、时间等），严格同等的细胞生长条件所获得的细胞脂肪酸的检测数据才具有鉴定学意义的可比性。

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（责任编辑 马鑫）

The Influence Factors of Determination of Haematobacter sp. Cellular Fatty Acids

He Weihong1An Mingli1Chen Guocan1Jia Bin1，3Wu Xiaolei2Wang Yanan1
（1. Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province，Zhengzhou 450008；2. College of Engineering，Peking University，Beijing 100871；3. College of Life Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060）

Cellular fatty acid composition of strain HNMC11807， a novel species belong to Haematobacter sp.， were detected by used Sherlock MIS system of MIDI company USA. The influence by different culture methods and cells growth conditions on cells fatty acid composition were explored in this article. Based on the bacterial cells cultured in varied medium such as in different medium components and in solid or liquid medium， the cellular fatty acid composition were respectively analysed and compared. On the same time， two standard systems in this instrument， conventional and fast， were used to run samples， and the detect results of the cellular fatty acid composition were compared respectively. As the results， the cells fatty acid composition was closely related with culture condition and a significant differences. The cellular fatty acid composition must be carried out in specified and unified culture conditions when this system was used in microbial classification.

determination of cells fatty acids；condition of medicum；standards of fatty acids；Haematobacter sp.

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.032

2014-10-04

国家自然科学基金项目（31100582），河南省基础与前沿技术研究计划项目（102300413217）

何蔚荭，女，高级实验师，研究方向：微生物系统分类与鉴定；E-mail：heweihong-70@163.com

王亚南，女，博士，副研究员，研究方向：环境微生物菌种资源开发与应用；E-mail：wangyanan@mail.tsinghua.edu.cn