斯达油脂酵母中自噬与油脂积累的关联性分析

韩冰 杨琴 崔清华

（云南大学生命科学学院，昆明 650091）

斯达油脂酵母中自噬与油脂积累的关联性分析

韩冰 杨琴 崔清华

（云南大学生命科学学院，昆明 650091）

旨在证明斯达油脂酵母中自噬参与油脂积累过程。在不同油脂积累水平下，检测相关自噬基因的表达，观察自噬与油脂积累是否有潜在相关性；用自噬促进剂促进自噬后，观察酵母油脂积累水平是否有差异。结果表明，与油脂低积累水平相比，在油脂高积累条件下，斯达油脂酵母自噬水平较低；用自噬促进剂处理后，酵母油脂积累降低。在斯达油脂酵母中，自噬与油脂积累成负相关性，自噬水平的提高会使酵母中油脂积累降低。

自噬；斯达油脂酵母；油脂积累；泛素样共轭体系

细胞自噬（autophagy）是真核细胞中高度保守的细胞内自身降解的代谢过程［1］，通常细胞自噬的发生主要是将部分胞浆和坏死或衰老的细胞器隔离在具有双层膜结构的囊状自噬体中，通过自噬体运输，将这些细胞成分运送到降解性的细胞器（如动物细胞的溶酶体和植物细胞的液泡）中进行分解，分解产生的大分子物质进一步回收利用。自噬是细胞内自我更新的重要途径，对细胞的生命维持和细胞繁殖具有重要的意义。在真核细胞中，主要存在3种类型的自噬，即大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）。这些自噬过程不仅有明显的功能分工，而且它们的作用机理显著不同［2］。由于在小自噬和分子伴侣介导的自噬的研究进展一直比较缓慢，一般所说的自噬通常指的是大自噬。大自噬的发生主要是通过自噬相关蛋白Atg（Autophagy-related genes）来实现的。

一般来说，大自噬主要涉及两个过程：自噬的诱导（图1-A）和自噬体的形成（图1-B）。在自噬体的形成和成熟过程中起关键作用的是两个自噬泛素样共轭体系：Atg8-PE（磷脂酰乙醇胺）和Atg12-Atg5-Atg16系统［3］。细胞自噬水平一般通过共轭体系的表达量来衡量。Atg8-PE体系的形成是通过新合成的Atg8蛋白的C末端甘氨酸残基在半胱氨酸蛋白酶Atg4的作用下暴露出来，随后在泛素活化样酶（E1）Atg7和泛素结合样酶（E2） Atg3的作用下激活Atg8，并通过甘氨酸与PE结合［4］。此外，新合成的Atg12蛋白在E1样酶Atg7和E2样酶Atg10的作用下与Atg5结合，最终Atg12-Atg5缀合物与Atg16结合形成Atg12-Atg5-Atg16体系。

图1 自噬过程

真核细胞自噬的发生通常是程序化的调控过程，特别是由丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶TOR（Target of rapamycin）介导的信号调控通路，在自噬的发生过程中经常起着主导作用。在正常营养条件下，TOR处于激活状态，细胞自噬受到抑制；当细胞处于营养饥饿的条件下，TOR被抑制，使得Atg13与Atg1、 Atg17的亲和力上升，形成大量的Atg1-Atg13-Atg17激酶复合物，这些激酶复合物进一步诱导细胞自噬增强［5］。除了TOR信号通路，磷脂酰肌醇-3-激酶（PtdIns3K）复合物I也对细胞自噬起着非常重要的调控作用。PtdIns3K复合物I是一种脂质激酶，包含4种组分，即Vps34、Vps15、Vps30/Atg6和Atg14［6］。PtdIns3K复合物I定位到PAS（Preautophagosomal structure/Phagophore assembly site）位点（自噬体形成的位点）并形成磷脂酰肌醇-3-磷酸（PtdIns（3）P）进而通过PtdIns（3）P募集自噬体形成必须的Atg蛋白。PtdIns（3）P主要的下游蛋白是Atg18和Atg21，Atg2-Atg18复合体在自噬体膜的转运中发挥着重要作用。

自噬通常参与细胞的发育和分化、维护细胞的生命以及调节生命的延长等重要的生理过程。最近的研究发现自噬可能与油脂代谢有紧密的联系。Lapierre等［7］在线虫中发现，自噬作用参与了线虫油脂代谢，通过清理细胞内多余脂肪，促进了能量的重新利用，最终延长了机体的寿命；Heaton和Randall［8］研究发现登革病毒能够通过调控寄主自噬来提高油脂代谢水平，进而产生大量ATP提供病毒复制的能量；Vescovo等［9］的研究发现，自噬可以抵消由丙型肝炎病毒引起的油脂代谢改变，自噬的中断会促进携带丙型肝炎病毒病人脂肪肝的发展；特别是Singh等［10］在小鼠的肝细胞中发现，自噬参与了脂滴中油脂的降解，并且提出了一个“脂类自噬”的模型，在调控通路的作用下自噬泛素样共轭体系会在脂滴外膜上聚集并包裹着一部分脂滴形成“脂类自噬体”，脂类自噬体包裹着含有三酰甘油的脂滴与溶酶体融合并被溶酶体内的水解酶水解形成脂肪酸，随后脂肪酸在线粒体内通过β-氧化为细胞提供能量。这些在动物细胞中的研究都预示着自噬在油脂代谢中的主要作用是通过降解脂肪来实现的。然而，Zhang等［11］的研究发现在产油酵母-圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）中，在细胞增殖和油脂累积过程中自噬相关基因，如Atg1、Atg2、Atg8和Atg20，表达水平显著上调，强烈预示了这些自噬相关基因可能参与了油脂的生物合成过程。但是对自噬相关基因参与油脂累积的代谢机理至今知之甚少。在酵母中，自噬相关基因是否参与调控了油脂的生物合成还不清楚。

斯达油脂酵母（Lipomyces starkeyi）是一种重要的产油酵母，由于细胞能够利用多样的碳源，高效累积储存油脂（单细胞油脂累积能够达到干重65%），斯达油脂酵母在工业上利用微生物工程化产油的生产实践中受到高度关注［12］。本研究通过调查斯达油脂酵母在油脂累积过程中自噬泛素样共轭体系基因的表达规律，揭示酵母中细胞自噬与油脂积累的内在联系，不仅有助于探讨在酵母中自噬相关基因参与调控油类代谢的分子机理，而且对提高产油效率的斯达油脂酵母菌株工程化改良具有参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 斯达油脂酵母AS 2.1560，由中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）提供，保藏于-80℃中。

1.1.2 培养基 YPD培养基成分包括：酵母膏10 g/L；蛋白胨20 g/L；葡萄糖20 g/L；琼脂15 g/L（固体培养基）。基础发酵培养基［13］成分包括：KH2PO412.5 g/L；Na2HPO41 g/L；（NH4）2SO40.5 g/L；MgSO4·7H2O 2.5 g/L；CaCl2·2H2O 0.25 g/L；酵母浸粉 1.9 g/L；葡萄糖 36 g/L；微量元素溶液 0.625 mL；pH5.0。其中微量元素溶液的成分：FeSO4·7H2O 16 g/L；MnSO4·H2O 4 g/L；Al2（SO4）3·18H2O 5.52 g/L；CoCl2·6H2O 2.92 g/L；ZnSO4·7H2O 0.8 g/L；Na2MoO4·2H2O 0.8 g/L；CuCl2·2H2O 0.4 g/L；H3BO30.2 g/L；KI 1.6 g/L，所有成分溶于5 mol/L的盐酸中。基础发酵培养基各成分溶解于去离子水中，高压灭菌。

1.2 方法

1.2.1 培养方法 用接种针蘸取少量菌液，在YPD平板上划线培养直至出现单克隆（约5 d），挑取单克隆于装有30 mL YPD液体培养基的三角瓶（100 mL）中，30℃，200 r/min培养2 d。吸取500 μL菌液于新的YPD液体培养基中，30℃，200 r/min培养2 d，在600 nm处检测菌液OD值并根据OD值吸取一定量的菌液于2 mL EP管中，离心收集并用灭菌水洗2遍，然后分别转移到装有30 mL碳氮比30和150发酵培养基的三角瓶（100 mL）中，使菌液起始OD值为0.4，30℃，200 r/min培养，每24 h收集菌液进行后续检测。不同碳氮比培养基是在基础发酵培养基的基础上配制的，在其他成分不变的前提下，改变基础发酵培养中氮源（酵母浸粉和硫酸铵）的含量使得碳元素和氮元素的比值为30和150（硫酸铵和酵母浸粉同比例增加或减少）。

1.2.2 Atg蛋白的鉴定与序列分析 以酿酒酵母数据库（http：//www.yeastgenome.org/）和拟南芥数据库（http：//www.arabidopsis.org/）里已知的Atg蛋白序列作为探针，在斯达油脂酵母数据库（http：//genome. jgi.doe.gov/pages/blast.jsf？db=Lipst1_1）中进行blastp比对，对于具有显著E值（＜10-5）的蛋白被认为是潜在的斯达油脂酵母Atg蛋白。同样的方法用于鉴定毕赤酵母（Pichia pastoris）潜在的Atg蛋白。在在线服务器GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）中，通过比对酿酒酵母、毕赤酵母和斯达油脂酵母共轭体系中自噬相关基因的基因组和cDNA序列，检测这些基因的外显子和内含子的分布。

1.2.3 油脂含量的检测 采用磷酸-香草醛法检测油脂含量［14］。取2 mL菌液，12 000 r/min离心10 min，蒸馏水洗2次。定容至2 mL，取50 μL（对照取蒸馏水），加入一带塞试管中，加入18 mol/L H2SO41 mL，沸水浴中孵化10 min，常温水浴5 min，加入2.5 mL磷酸-香草醛试剂，37℃保温1 h，常温水浴10 min，于530 nm测其OD值。剩余的1.95 mL菌液烘干，测量干重。油脂含量=（0.10718+3.63×吸光度）/干重。

1.2.4 自噬共轭系统的表达检测 采取液氮研磨法提取RNA。离心收集一定量的酵母菌液，用蒸馏水洗涤3遍，离心收集菌体并放入液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨将研磨后的菌体转移到装有1 mL Trizol的试管中，在涡旋仪上震荡30 s，室温静置5 min，4℃，12 000 r/min离心15 min；取上清加入0.2 mL氯仿，震荡15 s，静置5 min；4℃，12 000 r/min离心15 min，取上清，加入等量的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10 min；4℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清；加入1 mL 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7 500 r/min离心5 min，弃上清；待乙醇挥发完全，加入适量RNase free水溶解。吸取少量提取的RNA通过1%琼脂糖凝胶进行检测，确定提取的RNA无明显降解（有3个明亮条带），通过Thermo Scientific NanoDrop 2000进行浓度和纯度的检测，A260/A280值在1.8-2.0之间说明RNA纯度较好。提取的RNA通过宝生物公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒进行逆转录，逆转录体系中加入1 μg的RNA模板，逆转录后通过Thermo Scientific NanoDrop 2000检测体系中cDNA浓度，并将所有样品的cDNA浓度稀释到100 ng/μL。通过Real-time PCR的方法检测自噬共轭体系转录水平的表达，使用的仪器为Applied Biosystems7300，使用的荧光染料为宝生物的SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus），PCR体系为20 μL，cDNA模板量加入200 ng。共轭体系所涉及到的基因引物序列如表1所示，引物扩增片段为80-150 bp之间，Tm值为60℃左右。

表1 Real-time PCR引物

1.2.5 自噬诱导剂-雷帕霉素处理对油脂累积的影响 为了检测自噬活性增加后对油脂累积的影响，在斯达油脂酵母培养基中增加了细胞自噬诱导剂-雷帕霉素。首先将雷帕霉素溶解于DMSO中（使其储存浓度为10 000 μmol/L），再分别加入到碳氮比30和150培养基中，使雷帕霉素在培养基中的浓度为0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L（不同浓度的雷帕霉素溶解于相同体积的DMSO中），揺菌培养4 d后，检测细胞的油脂含量。

2 结果

2.1 斯达油脂酵母中自噬相关基因的鉴定与序列分析

基于斯达油脂酵母全基因组序列，以酿酒酵母和拟南芥中已知的Atg基因氨基酸序列为搜索探针，以序列相似性E值＜10-5阈值为标准，共鉴别了13个潜在的斯达油脂酵母Atg基因（表2），根据这些基因在酿酒酵母和拟南芥自噬过程中的作用，13个潜在的斯达油脂酵母Atg基因作用于不同自噬过程，包括Atg3、Atg4、Atg5、Atg7、Atg8、Atg12参与形成以Atg8和Atg12为主体的自噬泛素样共轭体系，Atg1、Atg6、Atg13、Atg20和Vps15、Vps34参与到上游的自噬调控通路中，Atg2、Atg9和Atg18参与到Atg9循环系统中。

通常，自噬泛素样共轭体系在自噬过程中发挥着极其重要的作用。参与这些过程的Atg基因结构，尤其是外显子（exon）和内含子（intron）在基因组中的分布规律，包括数量和发生位置，能够反映基因的产生和进化过程［15］。为了进一步检查酵母自噬泛素样共轭体系在基因结构上的保守性，我们根据毕赤酵母的基因组序列，鉴别了毕赤酵母泛素样共轭体系相关的基因，比较分析了酿酒酵母、毕赤酵母和斯达油脂酵母泛素样共轭体系基因的结构，包括内含子的数目和位置、特征性位点。如图2所示，酿酒酵母6个基因都没有内含子，毕赤酵母的Atg8和Atg12各有1个内含子，而斯达油脂酵母的每个Atg基因都有内含子，其中Atg3和Atg12的内含子数为1个，Atg4、Atg5和Atg8的内含子数均为3个，Atg7的内含子数为5个。比较斯达油脂酵母和毕赤酵母内含子发生的位置发现，尽管毕赤酵母的Atg8和Atg12各只有一个内含子，但他们发生的位置和斯达油脂酵母相似。通过比对在酿酒酵母中每个基因已经鉴别到的特征位点发现，斯达油脂酵母和毕赤酵母都具有相似的位点，包括Atg3和Atg7中的半胱氨酸位点（C），Atg5中的赖氨酸受体位点（K），Atg8和Atg12上参与共价结合的保守甘氨酸位点（G）（毕赤酵母未检出保守甘氨酸位点），以及Atg4蛋白水解活性的半胱氨酸位点（C）。这些结果说明酵母共轭体系蛋白的保守性很强，可能与Atg蛋白相似的功能有关。然而，这些基因序列的长度以及特征位点的位置在3个酵母中有很大的变异，特别是斯达油脂酵母在基因结构上和其它两个酵母有更大的差异，反映了在系统发生上斯达油脂酵母和其它两种酵母的关系较远。

表2 斯达油脂酵母自噬相关蛋白

2.2 斯达油脂酵母油脂积累过程中泛素样共轭体系基因的表达分析

研究已经发现酵母细胞油脂累积通常受到培养基中的碳氮比的强烈诱导［16］。在我们前期的研究发现，斯达油脂酵母在碳氮比为30和150的培养条件下，细胞生长良好、且累积油脂呈现了很大的差异。因此，本研究进一步检测了斯达油脂酵母分别在碳氮比为30和150的培养条件下，不同时期油脂的累积规律（图3）显示，油脂快速累积主要发生在细胞培养的前4 d，在培养第4天时细胞干重的油脂含量相差很大，在碳氮比为30和150的培养条件下油脂累积分别为31.2%和49.4%。

为探讨斯达油脂酵母油脂的累积是否与自噬相关，我们同时检测了在细胞生长过程中，泛素样自噬共轭体系相关基因（包括Atg3、Atg4、Atg5、Atg7、Atg8和Atg12）随着油脂的积累在转录水平上基因的表达变化。由于油脂快速累积主要发生在细胞培养的前4 d，因此我们集中检查了斯达油脂酵母细胞在前4 d的表达规律。将碳氮比150条件下培养1 d的细胞中自噬相关基因的表达量设为1，其它时期基因的表达量和培养1 d的比较，获得基因的相对表达量。如图4所示，在碳氮比为30培养下条件6个Atg基因的表达均高于碳氮比为150培养条件下基因的表达，说明斯达油脂酵母在高的碳氮比培养下Atg基因的表达降低。在碳氮比为30 的培养条件下，随着培养时间的增加，Atg3、Atg4、Atg5和Atg7的基因表达均呈下降趋势，而Atg8呈上升趋势，Atg12在开始阶段呈上升趋势，随后开始下降；在碳氮比为150的培养条件下，随着培养时间的增加，6个基因的表达量变化不大。

图2 斯达油脂酵母（Ls）、毕赤酵母（Pp） 和酿酒酵母（Sc）自噬共轭体系基因结构图

2.3 促进自噬可降低油脂积累

雷帕霉素（rapamicin）作为TOR的抑制剂，有助于Atg13的去磷酸化，进而促进Atg1-Atg13-Atg17激酶复合物的形成并诱导自噬。为了检测细胞自噬对油脂累积的影响，我们利用自噬诱导剂雷帕霉素，分别在碳氮比30和碳氮比150培养条件下促进酵母的自噬活动，培养4 d后检测不同雷帕霉素处理浓度的酵母生物量（通过检测OD值），发现酵母生物量变化不大，说明不同浓度的自噬诱导剂对细胞生长的影响非常有限。进一步检测细胞的油脂含量，结果（图5）显示，在碳氮比30和碳氮比150的培养条件下，随着雷帕霉素处理浓度的增加斯达油脂酵母的油脂含量呈下降趋势，在低浓度（如1和10 nmol/L）的雷帕霉素处理下，斯达油脂酵母细胞油脂累积没有显著变化，而在高浓度（如100-10 000 nmol/L）的雷帕霉素处理下，油脂累积显著降低，特别是在碳氮比150条件下，高浓度的雷帕霉素处理大幅度降低了斯达油脂酵母细胞的含油量。这个结果说明在斯达油脂酵母中细胞自噬活性增加确实能够减少细胞储存油脂的累积。

图3 不同碳氮比条件下的油脂累积曲线

图4 自噬共轭体系相关基因的表达

3 讨论

本研究基于斯达油脂酵母的基因组序列，利用生物信息学方法鉴别了参与细胞自噬的13个Atg基因，集中分析了斯达油脂酵母泛素样共轭体系基因的结构特征，通过与酿酒酵母、拟南芥Atg基因进行序列比对发现，斯达油脂酵母不仅存在自噬过程中所涉及到的关键Atg基因，而且自噬泛素样共轭体系基因的保守位点与酿酒酵母完全相同，这说明真核生物中自噬是一个高度保守的过程。然而基因结构的显著差异，说明斯达油脂酵母自噬共轭体系基因在系统发生上与毕赤酵母和酿酒酵母关系较远。

研究已经发现在产油酵母的培养过程中碳氮比能够显著影响细胞的油脂累积，增加碳源或减少氮源都能促进产油酵母的油脂累积。本研究利用减少氮源的方式来调节碳氮比，在高碳氮比的条件下（碳氮比为150）斯达油脂酵母细胞累积油脂显著增加。在高碳氮比培养条件下，随着细胞油脂的累积，参与自噬相关基因的表达均显著低于低碳氮比条件下的细胞培养，可能预示着随着细胞自噬活动降低确实减少了油体的降解，从而增加了油脂的累积。然而，在高碳氮比条件下，实际上相当于减少了培养基中的氮源，使细胞处于缺氮的逆境中，由于氮源是蛋白质合成的主要成份，而细胞自噬活动主要是依靠Atg蛋白的相互作用来实现的，因此，本研究在高碳氮比条件下Atg基因的表达降低也可能是由于氮源的缺乏而引起的。

图5 雷帕霉素处理对斯达油脂酵母的油脂含量影响

在利用酵母细胞自噬诱导剂增加Atg活性的试验中，结果显示了在一定浓度范围内自噬诱导剂雷帕霉素不影响斯达油脂酵母的细胞生长，但随着雷帕霉素的增加细胞油脂的累积显著降低，说明酵母细胞自噬活动可能直接降解细胞内油体，而减少细胞油脂累积。从本研究结果来看，在产油酵母油脂累积过程中，细胞自噬的活动和油脂累积呈负相关，暗示了细胞自噬相关基因确是通过降解活动参与了产油酵母的油脂代谢活动。然而，自噬活动在酵母细胞繁殖和生长过程中参与和调控了广泛的代谢和生理过程，且生理调控机制通常是复杂的［17］，而且本研究也缺乏在蛋白水平上引起自噬活动变化的证据，自噬相关基因对油脂累积的调控是通过调节油脂合成通路中的关键酶，从而减弱了油脂累积，还是直接参与油体的降解减少油脂的累积，这些问题尚不清楚，有待深入研究。

4 结论

本研究基于斯达油脂酵母的全基因组鉴别了13个参与细胞自噬过程的Atg基因，针对泛素样共轭体系的自噬基因，结合其它酵母自噬基因的序列结构，集中分析、比较了斯达油脂酵母泛素样共轭体系基因的结构特征，发现虽然酵母自噬基因的功能位点很保守，但在物种间基因的结构变异较大。在不同碳氮比的培养条件下，斯达油脂酵母细胞油脂累积和泛素样共轭体系基因的表达呈负相关，通过人为调节细胞自噬水平，进一步验证了细胞油脂累积和自噬活性呈负相关的规律，强烈地预示着酵母细胞自噬活动参与（或影响）了油脂累积过程。

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（责任编辑 马鑫）

An Investigation of Cellular Autophagy and Oil Accumulation in the Oleaginous Yeast Lipomyces starkeyi

Han Bing Yang Qin Cui Qinghua
（The School of Life Sciences，Yunnan University，Kunming 650091）

It was to prove autophagy is involved in the accumulation of lipid in Lipomyces starkeyi. Detecting the expression of autophagyrelated gene in different lipid accumulation level to determine whether autophagy is potentially involved in lipid accumulation； promoting autophagy by autophagy accelerator to observe whether there are differences in yeast lipid accumulation level. Results showed that the level of autophagy is low in high lipid accumulation condition compare with low condition. After treatment with autophagy accelerator， the lipid accumulation in yeast is reducing. In Lipomyces starkeyi， autophagy is negatively related to lipid accumulation， the improving of autophagy level will reduce the lipid accumulation in yeast.

autuphagy；Lipomyces starkeyi；oil accumulation；autophagy ubiquitin-like conjugated system

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.031

2014-07-14

云南省创新团队基金项目（2011C1123），国家自然科学基金项目（31160237）

韩冰，男，硕士研究生，研究方向：自噬与油脂代谢关系的研究；E-mail：1017830953@qq.com

崔清华，女，教授，研究方向：自噬与肿瘤关系研究；E-mail：cuiqinghua@ynu.edu.cn