重楼皂苷D抑制A549细胞转移作用及机制研究

吕芸，李晓玲

（1.陕西省西安市第四医院，陕西西安710004；2.中国人民解放军第四军医大学，陕西西安710032）

重楼皂苷D抑制A549细胞转移作用及机制研究

吕芸1，李晓玲2

（1.陕西省西安市第四医院，陕西西安710004；2.中国人民解放军第四军医大学，陕西西安710032）

目的观察重楼皂苷D对结肠癌细胞A549迁移与侵袭，以及基质金属蛋白酶2及9（MMP-2，MMP-9）表达的影响。方法培养结肠癌细胞A549，加入不同质量浓度的重楼皂苷D（1，2μmol/L），采用划痕试验，Transwell侵袭试验观察重楼皂苷D对A549迁移与侵袭的影响，以免疫印迹试验（Western Blot）法检测细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达。结果与结论重楼皂苷D可有效抑制结肠癌细胞A549的迁移、增殖与侵袭，可浓度依赖性地降低MMP-2和MMP-9的表达。机制可能为其降低了MMP-2和MMP-9的表达。

重楼皂苷D；迁移；侵袭；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9

40%的肺癌患者初诊时已发生淋巴结转移，确诊肺癌后5年生存率不足13%，这与肺癌易发生侵袭、转移有关［1］。因此，寻找能有效抑制肺癌转移的药物，对于改善肺癌患者的生存质量具有重要意义。重楼又名七叶一枝花，为百合科植物，以根茎入药，具有镇咳平喘、消肿止痛、清热定惊、败毒抗癌等功效；主要用于针对痈肿肺痨久咳、淋巴结核、骨髓炎、跌打损伤、蛇虫咬伤等症；具有生物活性的主要成分是多种甾体皂苷［2-4］。本试验中观察了重楼皂苷D对肺癌细胞A549增殖与转移的抑制作用，并初步研究了其相关作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

重楼皂苷D（纯度＞98%）购自上海纯优生物有限公司。人肺癌细胞株A549购于美国ATCC公司；培养基（DMEM，Hyclone公司，批号为NAD1269）；胎牛血清（Thermo Fisher公司，批号为140202）；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA，北京索莱宝公司，批号为20140211）；β-肌动蛋白（actin）抗体（Bioworld公司，批号为AP0060）；基质金属蛋白酶（MMP）-2，9抗体（Epitomic公司，批号为ARE6040，ARE6041）。

1.2 方法

细胞培养及药物处理人肺癌细胞：将A549细胞加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，置37℃及5%CO2细胞孵箱内培养。重楼皂苷D以DMSO配置为1mmol/L母液，置4℃冰箱保存，临用前稀释成工作浓度，工作浓度为1，3，10，30μmol/L。

MTT法检测细胞增殖率：取生长良好的A549细胞以2×103个/孔的密度接种于96孔板内，置37℃及5%CO2培养箱中过夜，使细胞充分贴壁后随机分组，每组设3个平行孔。给药处理组分别加入含各种浓度的重楼皂苷培养液（1，3，10，30μmol/L）200μL，并继续培养24 h。取出培养板，每孔加入5 g/LMTT溶液20μL，再继续孵育4 h。弃去孵育液，每孔加入150μLDMSO，于微量振荡仪上低速振荡10min，待结晶物充分溶解后，在Bio-Rad酶标仪上检测各孔在490 nm波长处的吸光度（OD）值。计算细胞增殖率，细胞增殖率（%）=（试验组OD值-对照组OD值）/对照组OD值×100%。重复3次。

划痕试验：取生长良好、处于对数生长期的A549细胞，以2×105个/孔密度接种至24孔板中。待细胞贴壁生长至融合时（约24 h），用200μL移液头在细胞层上划出一道划痕。磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次后，加入含1.5%胎牛血清的DMEM培养液，倒置显微镜下捕捉0 h划痕图片。培养24 h后，显微镜再次捕捉划痕图片。

Transwell侵袭试验：包被基底膜，50mg/L的基膜基质以1∶8稀释，包被Transwell小室底膜的上表面（约80μL/孔），室温风干；水化基底膜，吸出孔中残余液体，每孔加入50μL含1%牛血清白蛋白（BSA）的无血清培养液，37℃孵育30min；接种细胞，制备细胞悬液，细胞浓度调整为5×105/mL，每孔膜的上层加入细胞悬液100μL，下层加入含5%胎牛血清的DMEM培养液。细胞培养12 h后，用4%多聚甲醛室温固定膜下层细胞15min。PBS清洗3次后，行结晶紫染色，显微镜照相，捕捉图片。

免疫印迹试验（Western Blot）法测定MMP-2和MMP-9的表达：以细胞刮刮取对照组和重楼皂苷D处理24 h（1，2μmol/L）细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，蛋白定量、变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜。NC膜用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加兔抗MMP-2（1∶500）、MMP-9（1∶500）及鼠抗β-actin（1∶1 000）一抗4℃孵育过夜，PBS洗膜后加1∶7 000稀释的相应辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗，室温孵育2 h，洗膜后，采用ECL发光液进行化学发光。

1.3 统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件中的单因素方差分析（ANOVA）进行数据统计。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑制A549细胞的增殖

以不同浓度重楼皂苷D处理A549细胞24 h后，采用MTT法测定各组OD值。结果显示，与对照组相比，重楼皂苷D（1，3，10，30μmol/L）作用于细胞24 h后能显著抑制A549细胞增殖，抑制率分别为（10.01±1.07）%，（17.67±3.01）%，（54.96±8.13）%，（71.66±4.61）%（P＜0.01），作用呈浓度依赖性，见图1。

图1 重楼皂苷D对A549细胞增殖的影响

2.2 抑制A549细胞的迁移

1μmol/L及2μmol/L的重楼皂苷D孵育细胞24 h后，细胞的迁移均受到明显抑制，抑制率为（23.46±3.53）%和（48.92±4.26）%（P＜0.01），作用呈一定的浓度依赖性，见图2。

图2 重楼皂苷D对A549细胞迁移的影响

2.3 抑制A549细胞的侵袭

在对照组中，大量的A549细胞从上层侵入到下方的小室。在重楼皂苷D处理各组，从上层进入下方小室的细胞显著减少（P＜0.01）。醋酸溶解结晶紫后，在570 nm波长处读取OD值，发现该作用呈浓度依赖性，1μmol/L组和2μmol/L组侵袭抑制率分别为（21.33±4.63）%和（56.37±2.11）%（P＜0.01），见图3。

图3 重楼皂苷D对A549细胞侵袭的影响

2.4 对A549细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响

Western Blot法检测结果表明，重楼皂苷D可使A549细胞中MMP-2和MMP-9的表达水平呈浓度依赖性降低，见图4。

图4 重楼皂苷D对A549细胞中MMP-2，MMP-9表达的影响

3 讨论

本试验结果表明，重楼皂苷D可浓度依赖性地抑制A549的迁移和侵袭。肿瘤迁移和侵袭是决定肿瘤恶性程度的重要因素。肿瘤细胞外基质及基底膜的降解和破坏在肿瘤浸润和转移过程中发挥重要作用。MMPs是一类与锌结合、能降解细胞外基质活性的酶类，在正常生理条件下，其合成、分泌及降解受到严格调控。而恶性肿瘤细胞分泌的MMPs酶活性明显增强，可促进肿瘤细胞的侵袭和转移。在MMPs中，MMP-2和MMP-9是参与细胞外基质降解的主要成分，这两者是不同形式的Ⅳ型胶原酶，又称明胶酶A和明胶酶B。MMP-2主要由肿瘤间质细胞分泌，MMP-9则主要由肿瘤细胞分泌［5-10］。本研究结果显示，重楼皂苷D可浓度依赖性地降低细胞中MMP-2和MMP-9的表达水平。

综上所述，重楼皂苷D可能通过下调MMP-2和MMP-9的水平，从而发挥抑制A549细胞侵袭与迁移的作用。虽然重楼皂苷D的抑制结肠癌细胞转移的活性与机制有待进一步研究，但该结果将为重楼及其成分开发提供依据。

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Effect and Mechanism of Polyphyllin D on Metastasis of A549 Cells

Lyu Yun1，Li Xiaoling2
（1.The Fourth hospital of Xi′an，Xi′an，Shaanxi，China 710004；2.The Fourth Military Medical Universtiy，Xi′an，Shaanxi，China 710032）

Objective To investigate the effects of Polyphyllin D on the migration and invasion and the expression MMP-2，MMP-9 in human lung cancer cells A549.Methods A549 cells were administered with different concentrations of Polyphyllin D（1，2μmol/L）. Cell migration and invasion were then evaluated by wound healing and trans well assays.MMP-2 and MMP-9 expression were assessed by Western blot.Results Polyphyllin D can inhibit the migration and invasion of A549 significantly.Polyphyllin D can reduce MMP-2 and MMP-9 expression in a concentration dependent manner.Conclusion Polyphyllin D can inhibit A549 migration and invasion，the mechanism may be the expression of MMP-2 and MMP-9 are affected.

Polyphyllin D；migration；invasion；MMP-2；MMP-9

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2015）22-0035-02

2014-10-27；

2015-04-21）