新烷化剂替莫唑胺酯对胶质瘤细胞生长的影响

郭珊珊，朱仲玲，徐 辉，丁凤霞，王国成，赵 敏，阎 昭

（1.天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所，国家药物临床试验机构，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津 300060；2.天津天士力集团研究院，天津 300402）

多形性脑胶质瘤（GBM）是恶性程度最高的原发性脑肿瘤[1]。目前，术后替莫唑胺（TMZ）联合放疗是治疗GBM的标准方案。尽管如此，恶性脑胶质瘤患者的平均存活时间仅为15个月[2]。TMZ耐药是造成胶质瘤患者治疗效果不佳的主要原因。TMZ主要攻击细胞DNA，造成DNA烷基化损伤，进而形成DNA交联，导致细胞死亡[3]。在众多DNA烷基化损伤中，以O6-甲基鸟嘌呤（O6-mG）的损伤威胁最大，是引起细胞致死的重要原因[4]。机体对O6-mG的修复主要依赖O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT），此酶将甲基从DNA的O6位转移到自身半胱氨酸残基上，使DNA链上的鸟嘌呤损伤修复，同时MGMT不可逆地失活，是一种“自杀式”、可消耗酶[5-6]。临床研究一些MGMT抑制剂作为TMZ辅助化疗药物，如O6-BG，但是，临床试验发现，O6-BG具有神经毒性[7]。所以，设计既有TMZ活性作用，又能够消耗MGMT蛋白的药物具有重要的临床意义。TMZ-HE是在TMZ结构基础上改造而来，保留原有药物的作用基团，其目的为在保留原有药物的作用结构基础上，增加药物的脂溶性，使药物进入肿瘤内部的浓度增加。起初，TMZ-HE作为治疗皮肤癌而设计的前体药，能够抑制裸鼠异种移植的黑色素瘤的生长[8]。胶质瘤细胞LN-18由于自身MGMT表达属于原发性耐药细胞系[9-10]，本研究选取LN-18细胞系，旨在探索TMZ-HE体外对脑胶质瘤细胞的增殖抑制及诱导凋亡的作用，同时对MGMT蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 TMZ、TMZ-HE由天津天士力公司提供，纯度>99%。二甲基亚砜（DMSO）溶解配成100 mmol/L贮存液，置－20℃冻存。胶质瘤LN－18细胞购于ATCC，由本实验室冻存。改良Eagle培养基（Dulbecco’smodified Eagle’smedium，DMEM）胰蛋白酶购自Gibico公司，胎牛血清购自天津灏洋生物制品公司。四甲基偶氮唑蓝（MTT）、Hoechst33342荧光试剂盒、细胞凋亡试剂盒均为Sigma公司产品，MGMT抗体为CST公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 LN-18细胞用DMEM（含10%胎牛血清，1%双抗）培养液培养，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 MTT比色法 取对数生长期LN-18细胞，以0.25%胰蛋白酶消化，计数，稀释成1×104/mL的单细胞悬液，接种至96孔板，过夜贴壁后，加入含TMZ、TMZ-HE 终浓度为 62.5、125、250、500、1 000 μmol/L的培养液作为处理组及浓度为0μmol/L的等量DMSO对照组，每种浓度设4个重复孔，并以空白孔调零。药物作用24、48、72和96h后，每孔加入20μL 5mg/mLMTT,继续培养4 h,吸去上清,每孔加150μL DMSO,振荡10min。490 nm波长处酶标仪检测吸收值（OD），结果以各组OD均值±标准差表示（实验重复3次）。

1.2.3 二维克隆法 取对数生长期LN-18细胞，调整细胞密度为200个/mL，以每孔1mL接种于12孔板，待细胞贴壁后，各实验组加入含药培养液（25～200μmol/L），阴性对照组分别加入等量的不含药培养液，每组设2个复孔。每隔3 d换液，2周后取出培养板，甲醇-20℃固定10min,加入结晶紫染色液染色30min。显微镜下观察克隆大小及数量，>50个细胞为克隆，计数。

1.2.4 Hoechst33342/PI荧光染色 取对数生长期LN-18细胞，调整细胞密度为1×106/mL，以每孔1mL接种于24孔板，待细胞贴壁后，加入含TMZ、TMZHE（50～400 mol/L）培养液，作用 96 h 后，弃上清，PBS洗2遍，各孔均加入 Hoechst染料（10 g/mL）、PI染料（1μg/mL）500μL，37℃避光孵育 10min，弃去染料，加入培养液，荧光倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.5 流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率 TMZ、TMZ-HE（50～400 mol/L）作用LN-18细胞96 h，收集细胞，调整细胞浓度至1×105/mL，各取100μL；加入预冷的结合缓冲液100μL重悬细胞；加入5μLAnnexinV-FITC和PI染液于细胞悬液中,轻轻混匀，避光染色10min；补加200μL结合缓冲液，流式细胞仪检测凋亡的百分比。

1.2.6 Western blot法检测MGMT蛋白的表达 收取蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，将等量蛋白（约50μg）在15%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，电转移至PVDF膜后封闭，4℃孵育MGMT兔抗人单克隆抗体过夜，TBST洗膜3次，兔抗荧光二抗孵育，TBST洗膜3次，荧光扫描仪扫描。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件处理数据，组间分析比较用t检验。计量资料以x±s表示，采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TMZ-HE对LN-18细胞活力的影响 MTT结果显示，相同浓度梯度的TMZ、TMZ-HE作用胶质瘤LN-18细胞24～96 h后，两种药物均具有增殖抑制作用，且具有浓度和时间依赖性（图1）。TMZ在24、48、72、96 h 处的 IC50值分别为 （2 448±0.17）、（2 063±0.16）、（1 298±0.08）、（1 020±0.095）μmol/L，TMZ-HE 的 IC50值分别为 （318.2±0.03）、（215.9±0.04）、（204.3±0.04）、（178.3±0.05）μmol/L，作用 96 h TMZ和TMZ-HE的IC50值相差约5.72倍，具有显著统计学差异（P＜0.001）。以上结果表明，TMZ-HE对胶质瘤细胞LN-18的增殖抑制效果明显优于TMZ。

图1 TMZ,TMZ-HE作用LN-18细胞24、48、72、96 h后细胞存活率Fig 1 Survival ratesof the LN-18 glioma cells treated by different concentrationsof TMZ and TMZ-HE for 24,48,72 and 96 h

2.2 TMZ-HE对LN-18细胞克隆形成的影响 克隆结果显示，TMZ、TMZ-HE对LN-18克隆形成均有抑制作用，随着药物浓度增加，克隆形成数量也随着减少，但TMZ-HE的克隆抑制效果强于TMZ。如图2所示，TMZ-HE作用LN-18细胞后，克隆数量明显少于TMZ组，在200μmol/L的TMZ-HE作用下，能够完全抑制克隆形成，而TMZ仅能抑制40%。

2.3 TMZ-HE诱导LN-18细胞发生凋亡情况TMZ-HE作用LN-18细胞96 h后，细胞凋亡率（包括早期凋亡和晚期凋亡）分别为8.4%、13.5%、14.9%、36.9%，死亡率为2.4%、5.4%、3.1%、6.5%，而TMZ诱导LN-18的凋亡率为7.1%、8.8%、11.5%、28.7%，死亡率为3.3%、2.8%、4.3%、7.3%。其结果表明，TMZ-HE诱导胶质瘤LN-18细胞发生的凋亡高于TMZ，具有浓度依赖性。但是，TMZ和TMZ-HE引起细胞的死亡数量较少，且没有明显的浓度依赖性，见图3。

图2 不同浓度TMZ,TM Z-HE作用LN-18后克隆形成数量百分比Fig 2 Effectsof graded TMZ and TMZ-HE on LN-18 colony form ation

图3 TMZ,TMZ-HE作用LN-18细胞96 h后流式细胞仪检测细胞凋亡率和死亡率Fig 3 Apoptosisand necrosisof LN-18 cellsby flow cytometry after treated with TMZ and TMZ-HE for 96 h

2.4 Hoechst33342/PI荧光染色观察细胞核形态变化和细胞坏死情况 如图4A所示，TMZ、TMZ-HE作用LN-18细胞96 h后，荧光显微镜下观察可见细胞核荧光信号增强，同时，随着浓度增加，细胞核数量不断减少，但是相同浓度下的TMZ-HE组细胞核数量减少的更多。相同作用条件下，PI染色观察可见，随着两种药物浓度增加，坏死细胞没有明显增加，且荧光信号较少，几乎没有坏死，见图4B。这与笔者流式检测的结果相符，说明TMZ-HE更多的诱导LN-18细胞发生凋亡，且诱导细胞的凋亡率高于TMZ，其结果具有统计学意义。

图4 Hoechst33342(A)/PI(B)染色观察TMZ、TMZ-HE对LN-18细胞核的影响及坏死情况（×10）Fig 4 Hoechst33342(A)/PI(B)stainingwasobserved in TMZ,TMZ-HE effecton LN-18 cellnucleiand necrosis(×10)

2.5 TMZ-HE对LN-18细胞耐药蛋白MGMT的影响 Western blot结果显示，两种药物能够使MGMT表达量降低，其具有浓度依赖性。但是，TMZ-HE能够较TMZ更早更多的消耗MGMT蛋白，100μmol/L的TMZ-HE能够完全消耗细胞中MGMT蛋白，而TMZ则需要更高浓度，见图5。

图5 TMZ,TMZ-HE对LN-18细胞中耐药蛋白MGMT的影响Fig 5 Theeffectof TMZ,TMZ-HE on the resistant proterin MGMT in LN-18 cells

3 讨论

GBM是…级脑肿瘤，年发病率为5～8/10万，具有生长迅速、侵袭性强等特性，使得手术彻底切除困难，极易复发[11]。目前对GBM的治疗采用手术和放化疗的综合治疗方式[12]。TMZ是临床治疗恶性脑胶质细胞瘤的标准一线化疗药物。临床研究表明，TMZ对人恶性脑胶质瘤的有效率在45%左右，GBM对TMZ的耐药性是化疗失败的主要原因[7,13]。其中，DNA修复酶MGMT是耐药的主要原因之一[14-15]。有研究表明，白藜芦醇能够抑制MGMT蛋白的表达，与TMZ联合使用能够增加TMZ的敏感性[16]。TMZ治疗胶质瘤的作用效果与MGMT蛋白的消耗和合成的速率有关[5]。本研究通过检测TMZ-HE对LN-18的作用效果，可以初步探索TMZ-HE是否能够克服TMZ耐药。研究结果表明，新型烷化剂TMZ-HE能够较TMZ更早更多地降低胶质瘤LN-18细胞中MGMT蛋白的表达含量，相应可以增加DNA损伤，导致更多的细胞死亡。通过凋亡等相应功能性实验结果表明TMZ-HE的作用效果明显优于TMZ，具有统计学意义，说明TMZ-HE能够通过降低MGMT的表达增强对LN-18的作用效果。TMZ-HE是在TMZ结构基础上改造而来，保留了原有的作用基团，所以，通过凋亡检测和荧光染色结果可以发现TMZ和TMZ-HE都主要诱导LN-18细胞发生凋亡，而细胞死亡几乎没有检测到。这与Roos等[17]研究的TMZ能够诱导胶质瘤细胞发生凋亡的结果一致。但是，细胞发生凋亡的途径有很多，会受到各种因素的影响，如p53在胶质瘤细胞中的状态不同，会诱导细胞发生不同途径的凋亡[18]。所以，TMZ-HE诱导胶质瘤细胞发生凋亡的途径是否与TMZ完全相同，其增加的酯结构是否仅影响药物的渗透能力还有待进一步研究。

本实验通过MTT法、二维克隆法证明了TMZHE对胶质瘤细胞的短期和长期作用效果都优于TMZ，但两者有一个共同点，即长期的作用效果更加明显，200μmol/L TMZ能够抑制60%的克隆形成，TMZ-HE甚至完全抑制LN-18克隆的形成。TMZ诱导细胞凋亡发生的时间为96 h，这是因为TMZ首先导致胶质瘤细胞发生自噬，研究发现，通过药物抑制自噬能够增加TMZ诱导的凋亡[19-20]。TMZ-HE在96 h处诱导LN-18细胞发生更多的凋亡，这是由于TMZ-HE本身能够抑制自噬导致凋亡增多，还是和TMZ相同，先发生自噬，然后诱导更多的凋亡，这是笔者值得探讨的问题。

综上所述，本研究证明了TMZ-HE能够通过下调MGMT蛋白抑制胶质瘤细胞LN-18的增殖并诱导其凋亡，TMZ-HE较TMZ作用效果更好，对治疗胶质瘤有很好的应用前景。因此，TMZ-HE是否能够克服TMZ耐药以及诱导凋亡的机制是进一步研究的主要内容。这些研究大多数还是建立在体外实验上，由于体内外环境差别较大，要想更好地了解TMZ-HE在胶质瘤中的作用，还有待进一步开展TMZ-HE在体内的相关研究。

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