牵张力对C2C12细胞株MEF2A基因表达的影响

刘春利，刘晓伟，肖丹娜，高辉

（1.天津市口腔医院正畸科，天津300041；2.武警后勤学院附属医院口腔科，天津300162）

有些正畸治疗尤其功能矫形治疗或者正畸正颌联合治疗的病例，在治疗后不仅硬组织发生改建，相应的软组织也需要发生适应性改变，从而适应新的功能环境。颌面部肌肉结构和功能的适应性改建是这些治疗成功的一个关键因素[1-2]。机械牵张刺激对颌面部肌肉改建的影响与治疗效果的维持关系密切，因此摸索合适的机械牵张刺激对于治疗效果以及辅助矫治装置的研发有重要意义。肌细胞增强因子MEF2是一种调节肌肉特异性转录的基因，可以激活多种肌肉相关基因的表达，从而对肌肉组织的分化、维持和再生起重要作用[3]。MEF2A是其在骨骼肌中主要表达的亚型之一[4]，对MEF2A的研究是对骨骼肌细胞应答机制研究的重要组成部分。为了模拟机械牵张力对颌面部肌肉作用，本实验应用四点弯曲细胞加力装置对C2C12细胞施加不同时间段相同力度的机械牵张刺激，并通过实时荧光定量PCR检测加力刺激后C2C12细胞MEF2A的基因表达规律，初步探索0.5 Hz，加力板变形量2 000μstrain的牵张力对骨骼肌细胞的影响，为探索功能矫治的细胞及分子生物学机制提供实验依据。

1 材料及方法

1.1 细胞系和主要试剂及仪器 C2C12细胞，DMEM/F12培养基，新生小牛血清(成都哈里生物工程有限公司 )，CO2孵箱（Forma Scientific.Inc.美国），倒置相差显微镜及照相系统（OLY MPUS IX70），Forcel四点弯曲加力装置（四川大学华西口腔医学院正畸与成都电子科技大学联合研制），FTC2000实时荧光定量基因扩增仪（加拿大枫岭公司），Trizol（美国MRC公司），RevertAidTMFirstStrand cDNA Synthesis Kit（立陶宛 MBI公司），Gel Doc 1000凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司），引物合成及探针修饰（上海生物工程有限公司）。

1.2 小鼠成肌细胞株C2C12培养及加力

1.2.1 成肌样细胞株C2C12的传代培养 将成肌样细胞株C2C12按1×107/L的密度，接种于经多聚赖氨酸处理的中号玻璃培养瓶中，加入约10mL含10%新生小牛血清的DMEM/F12培养基，置于CO2孵箱(37℃，50mL/LCO2)。当C2C12细胞生长形成单层，铺满培养瓶底80%以上时，在无菌条件下传代。用PBS液清洗培养瓶3次，加入25 g/L胰酶和22 g/LEDTA，室温消化3～5min，加入含有10%新生小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，吹打细胞制成细胞悬液，按1×107/L密度分别置于各培养瓶中继续培养隔天换液。

1.2.2 实验分组 将实验细胞分两大组：第1组为空白对照组，第2组为加力组，每组按不同时段加力 1、2、4、8、12 h，每实验时段收集 3 个样本。

1.2.3 四点弯曲加力装置对C2C12细胞加力 将BD Falcon公司的75 cm2蓝盖斜颈细胞培养瓶从中间剖开，取细胞常规培养时用的底面（厚度1.15 mm），分成3 cm×8 cm大小两块，周缘平滑四角圆钝，以避免加力过程中的应力集中。洗净加力用细胞培养板，灭菌后接种细胞。采用传代后的C2C12细胞，按2×105密度接种于加力板上(实验组和对照组同时种板)，然后将其放入培养皿中，贴壁6 h后加入含100mL/L小牛血清的DMEM/F12培养基，于CO2孵箱中培养48 h后，再将培养基换为无血清的DMEM培养液继续培养24 h，以同步化C2C12的细胞周期。采用Forcel四点弯曲体外细胞力学加载装置对接种在加力板上的成肌样细胞进行加力，频率0.5Hz，加力板变形量为2 000μstrain，对细胞按不同时间段施加周期性牵张力。各加力组重复3次（n＝3），加力结束后分别收获细胞。

1.3 样本采集 以PBS冲洗加力后细胞，无菌滤纸吸净多余PBS液，然后原位裂解细胞，严格按照Invitrogen公司的TRIZOL试剂说明书提取RNA，并收取RNA样本置于经DEPC水处理过的1.5mL离心管中，存放于-20摄氏度。

1.4 RT-PCR检测MEF2A-mRNA的表达

1.4.1 引物设计与合成 MEF2A上游引物：5′－CACGCTACATAGAAATGTGT－3′，下游引物：5′－CTTGAGTTTACAAATCCATT－3′，探针：CTGTAGTGCTCAACATCCCAC，该产物产生144bpcDNA片段；ATCB：上游引物：5′－GAAGATCAAGATCATTGCTCCT－3′，下游引物：5′－TACTCCTGCTTGCTGATCCA－3′，探针：5′－ CTGTCCACCTTCCAGCAGA－3′，该产物产生111BP cDNA片段。

1.4.2 总RNA的提取和逆转录 在紫外分光光度计上测定RNA的浓度和纯度。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛MBI公司）试剂盒反转录成cDNA。

1.4.3 实时荧光定量PCR 以cDNA为模板进行PCR扩增，30μL反应体系中包含以下溶液或试剂：10×buffer3 μL，MgCl2(25mmol)3 μL，dNTP(25mmol)0.36 μL,PCR Forward Primer（10 μmol）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL，探针（10 μmol/L）0.6 μL，Template 0.3 μL，ddH2O 18.74 μL。两步法PCR扩增标准程序：预变性：94℃、2min 1个循环；PCR 反应：94 ℃、20 s，46 ℃、20 s，60 ℃、30 s 45 个循环。

1.5 统计学处理 利用SPSS 13.0统计分析软件包，采用t检验以及单因素方差分析对数据进行统计学分析，以P＜0.05为有显著性差别。

2 结果

2.1 实际ACTB内参和MEF2A相对分子质量条带 MEF2A与内参照ACTB的实际电泳条带和理论扩增条带基本一致，说明二者的实际扩增相对分子质量与理论值基本相符。凝胶电泳检查结果见图1。同时，总RNA提取完整无降解，满足后续实验的要求。见图2。

图1 ACTB和MEF2A扩增产物电泳条带Fig 1 Electrophoresisbanding amplification productsof ACTB and MEF2A

2.2 对照组与加力组MEF2A基因表达比较 采用t检验，相同时间段加力组与空白对照组相比，MEF2A基因表达量未见明显变化（P＞0.05），采用单因素方差分析对加力组不同时间段MEF2A基因的表达进行比较，发现加力后各时间段MEF2A基因表达强度未见统计学差异（P＞0.05），见表1。

表1 两组各时间点牵张力诱导MEF2Am RNA表达（Ct值）比较Tab1 CompareMEF2A geneexpression affected by strain forcebetween different timegroups

组别 样本数 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h空白组 15 6.90±0.605 6.45±0.491 6.91±0.314 6.99±0.340 6.01±0.439加力组 15 6.31±0.464 6.29±0.536 6.06±0.578 6.59±0.528 6.33±0.489

3 讨论

在口周肌肉受到的各种刺激当中，张力刺激尤为重要。因为口周肌肉附着在颌骨上，当咀嚼时或是戴用矫形装置时，颌面部骨骼肌会因被拉伸而处于张力作用下，矫形治疗中和治疗后颌面部骨骼肌改建及其稳定性与张力刺激有关。MEF2A广泛存在于骨骼肌中，其DNA结合活性在骨骼肌中高度表达[5]，参与调控肌细胞的分化和肌肉特异性蛋白表达[6-7]，张力刺激对于MEF2A影响的研究是研究张力对于骨骼肌改建影响的重要组成部分。

本研究中采用四点弯曲细胞力学加载仪，此装置采用梁变形原理，通过数控步进电机使细胞培养板发生形变，以此对培养板表面的细胞产生恒定的周期性张力。曾有学者对细胞的多种施力方式进行研究[8-9]，细胞可以耐受的应变量约1 000μstrain～4 000μstrain[10]。本实验中采用低频率（0.5Hz）2000μ strain大小的周期性张力，对C2C12细胞进行加力，加力后用显微镜观察加力板上的细胞，此力值在细胞所能承受力值范围内，而且该力下细胞的贴壁及生长情况良好，脱落率极低，符合本实验的要求。

以往研究表明周期性牵张力作为一种有效刺激对牙周膜细胞、骨髓破骨细胞等均有影响[11-12]，而其对骨骼肌细胞的影响也是近年来的研究热点。为了探明周期性牵张力对骨骼肌改建的细胞学机制，本研究选择MEF2A作为研究对象，MEF2A是成肌因子中的一个重要分型，此次研究也为后续研究周期性牵张力对其它成肌因子的影响提供实验依据。对C2C12细胞在周期性张力作用下，MEF2A基因表达检测发现，加力12 h以内MEF2A基因表达量与对照组比较和加力组各时间段横向比较均未见统计学差异，其表达量没有随时间延长而增加，各相邻加力时间之间MEF2A基因表达量未发现统计学差异，提示周期性牵张力在12 h以内不能以改变MEF2A基因表达的形式影响骨骼肌细胞。在矫形治疗中，短时间的加力过程可能不足以引起颌面部骨骼肌的明显改建，需要延长治疗中骨骼肌的受力时间，同时佐证了戴用功能矫治器建议每天戴用14 h以上甚至全天戴用[13]，才能保证治疗效果，并需要延长治疗满意后的效果保持时间。本次实验研究采用0.5Hz加力频率，型变量为2 000μstrain，在生理范围内其他频率和加力形变量对于C2C12的MEF2A基因表达的影响需进一步研究。

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