高效液相色谱荧光检测法测定22种桑叶中1—脱氧野尻霉素含量的研究

徐斌　张东阳　刘利等

摘要 [目的] 采用柱前衍生高效液相色谱荧光检测法（HPLCFLD），对22种桑叶中1-脱氧野尻霉素（DNJ）的含量进行测定。[方法] 采用水浴超声提取法提取桑叶中的DNJ，以9芴甲氧羰酰氯（FMOCCl）为衍生化试剂，在pH 8.5的K3BO3缓冲液中对DNJ进行衍生，生成的荧光物质FMOCDNJ用高效液相色谱荧光检测法检测。色谱流动相为乙腈—浓度0.1%乙酸水溶液。同时，对分离条件做了改进，采用梯度洗脱的方法对桑叶提取物中衍生化的DNJ进行分离。[结果]该方法的线性范围为2.02～40.50 μg/ml，线性相关系数为0.999 1；方法检出限、定量限分别为0.15、0.50 μg/ml。对样品进行加标回收试验，回收率范围为93.73%～97.91%。[结论] 该方法用于测定桑叶中DNJ的效果令人满意。

关键词 高效液相色谱法；衍生化；荧光检测；桑叶；1-脱氧野尻霉素

中图分类号 S-03 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-001-03

Abstract [Objective] The contents of 1deoxynojirimycin （DNJ） in 22 kinds of mulberry leaves were determined by derivatization with 9fluorenylmethyl chloroformate followed by highperformance liquid chromatography equipped with a fluorescence detector （HPLCFLD）.[Method] DNJ was extracted from mulberry leaves by water bath and ultrasonic extraction，then derivatized using FMOCCl in K3BO3 buffer solution （pH=8.5）.The fluorescent product FMOCDNJ was detected by HPLCFLD.The mobile phase was acetonitrile and water （containing 0.1% acetic acid）.The elution process was optimized，which was different from the articles reported before.The derivatized DNJ in the extracts of mulberry leaves was separated by a gradient elution.[Result] The linear range of the method is 2.02-40.50 mg/L and the correlation coefficient （R2） is 0.999 1.The limits of detection （LOD） and quantification （LOQ） of the method are 0.15 and 0.50 μg/ml，respectively.The range of recoveryis shown to be 93.73%-97.91%.[Conclusion] The effect of quantifying DNJ in mulberry leaves is satisfactory by the optimized HPLCFLD method.

Key words High performance liquid chromatography； Derivatization；Fluorescence detection； Mulberry leaves； 1deoxynojirimycin

1-脱氧野尻霉素（DNJ）是一種存在于桑叶中的多羟基哌啶类生物碱，具有降血糖[1-2]、抗病毒[3-4]、抗肿瘤[5]等生物活性。目前，桑叶中DNJ的检测分析方法有柱前衍生化高效液相色谱荧光检测法（HPLCFLD）[6]、高效液相色谱蒸发光检测法（HPLCELSD）[7]、高效液相色谱串联质谱法（HPLCMS/MS）[8]、气相色谱串联质谱法（GCMS）[9]等。对于液质、气质联用法，虽然质谱检测器具有更高的灵敏度以及专一性，然而质谱仪器价格较昂贵，检测成本很高。相比而言，采用光谱检测器的方法更具有普适性，有利于方法的推广。笔者对Kim等[6]和欧阳臻等[10]报道的HPLCFLD法在分离条件上做了改进和优化。采用改进后的HPLCFLD法对来自于全国12个省份的22种桑叶中DNJ含量进行测定，并取得令人满意的效果。这种改进的HPLCFLD法可以为准确测定桑叶中的DNJ含量提供可靠的分析手段。

1 材料与方法

1.1 桑叶样品

供试22种桑叶采自全国12个省份。将采摘的桑叶（枝条上部叶）用超纯水洗净，晾干，放入电热鼓风干燥机中于120 ℃下烘1 h，然后在100 ℃下烘干至恒重。取适量桑叶，放入研钵中磨成粉末，备用。

1.2 桑叶中DNJ的提取

准确称取0.20 g桑叶粉末，加入25 ml锥形瓶中，向容量瓶中加入20 ml浓度70%的乙醇水溶液（V/V），摇匀。对桑叶粉末进行水浴超声提取，水浴温度65 ℃，超声功率 100 W，时间 20 min。在水浴超声后，冷却至室温，抽滤，得到滤液、残渣，其中残渣按照上述流程再提取1次，冷却，抽滤；将2次得到的滤液合并，转移至50 ml容量瓶中，用超纯水定容。

1.3 DNJ标准溶液的配制

准确称取2.30 mg DNJ于10 ml容量瓶，用超纯水定容，得到 230 μg/ml DNJ标准储备液，放入4 ℃冰箱中保存。取适量DNJ储备液，用超纯水稀释，得到2.02、5.06、10.13、20.25、30.38、40.50 μg/ml标准溶液系列。

1.4 DNJ的衍生化

桑叶提取物溶液以及DNJ标准溶液的衍生化参照文献[6]。

1.5 试验条件

荧光检测器：激发波长 254 nm，发射波长 322 nm；色谱柱：Waters XBrige C18 柱 （150 mm× 4.6 mm，5 μm）；进样速度：1.0 ml/min，进样体积：10 μl，柱温：25 ℃。桑叶提取物的分离采用梯度洗脱，流动相 A为乙腈，流动相B为浓度0.1%乙酸水溶液（V/V），0～4 min 32% A+68% B，4～7 min 梯度过渡到75% A+25% B，7～10 min 维持75% A+25% B，10～12 min 梯度过渡到32% A+68% B，12～15 min 维持32% A +68% B。

2 结果与分析

2.1 流动相的优化

欧阳臻等[10]使用HiQSiLC18（250 mm×4.60 mm，5 μm）色谱柱，以流动相A∶B（V/V）55∶45对桑叶提取物中DNJ衍生物进行较好地分离[10]。然而，在实际试验中采用上述方法，对桑叶提取物溶液的分离效果并不理想。

从图1可以看出，当以流动相A∶B比例55∶45对桑叶提取物进行等度洗脱时，出峰将集中在1.5～2.8 min。对DNJ标准品进行衍生后，在相同的条件下进样（图2）。图1中色谱峰1（保留时间1.99 min）即为DNJFMOC。此外，图1中有2个倒峰，色谱峰2（保留时间2.99 min）为GlyFMOC，是 Gly（甘氨酸）与过量FMOCCl反应生成物；色谱峰3为FMOCOH（保留时间3.77 min），是FMOCCl的水解峰。这两个峰均为倒峰，是因为衍生后样品中这两种物质的含量过高，超出检测器的响应范围所致。从分离结果可以看出，目标成分DNJ出峰时间过早，说明流动相极性过小。此外，由于桑叶中存在多种与DNJ结构很类似的生物碱如荞麦碱（fagomine）、3表荞麦碱（3epifagomine）、1，4双脱氧1，4亚氨基D阿拉伯糖醇（DAB）等，这些物质在衍生化过程中同样会被衍生且与DNJ的保留时间相近[6]，加之出峰时间间隔过短，DNJ与这些物质没达到基线分离。

通过对流动相比例的优化，建立如下的洗脱梯度：0～4 min 32% A + 68% B，4～7 min 梯度过渡到75% A + 25% B，7～10 min 维持75% A + 25% B，10～12 min 梯度过渡到32% A + 68% B，12～15 min 维持32% A + 68% B。对桑叶提取物的分离效果见图3，对DNJ标准品衍生后在上述流动相下进样（图4），可以确定图3中色谱峰1是DNJFMOC（保留时间5.73 min）。相比于图1，DNJ衍生物的出峰时间被推至5.73 min。这是一个理想的出峰时间。图1中色谱峰黏连的问题得到很好的解决，DNJ与干扰物质完全被分离开。

2.2 标准曲线的建立

对2.02～40.50 μg/ml DNJ标准溶液系列进行衍生后测定，以DNJ标准溶液质量浓度为横坐标，以对应的色谱峰面积为纵坐标，进行线性回归拟合。由图5可知，在2.02～40.50 μg/ml的范围内，所得回归方程为y=2 220 591x-1 587 898，线性相关系数（R2）=为0.999 1。

2.3 方法检测限以及定量限的确定

方法检测限、定量限是通过所测得色谱峰的信噪比（S/N）来确定的。S/N=3对应的标准溶液浓度为该方法的检测限；S/N=10对应的标准溶液浓度为该方法的定量限。通过连续稀释DNJ标准溶液衍生后测定，得到该方法的检出限和定量限分别为0.15、0.50 μg/ml。

2.4 方法重复性与精密性试验

2.4.1 方法的重复性试验。对同一样品进行衍生后，连续测定6次，发现样品峰面积RSD为2.92%。

2.4.2 方法的精密性试验。分为日内精密性试验和日间精密性试验。对于日内精密性试验，对一个样品衍生后在同一日的不同时间内测定6次，发现样品峰面积RSD为4.21%。对于日间精密性试验，对一个样品衍生后连续3 d测定，发现样品峰面积RSD为3.83%。

2.5 方法回收率试验

选取一个样品，平行称取6份，分别加入相当于该桑叶样品测定含量50%、100%、150%的DNJ标准溶液。按照上述试验方法进行测定，计算方法回收率（表1）。

2.6 桑叶中DNJ含量

对来自全国12个省份的22种桑叶品种中DNJ含量进行测定。由表2可知，2种来源于四川省的鲁桑叶7、8（样品编号14、15）和1种来源于浙江省的鲁桑叶9（样品编号19）中DNJ含量明显高于其他省份，来源于湖南省的鲁桑叶10（样品编号20）中DNJ含量最低。

3 结论

利用高效液相色谱荧光检测法，测定了来自于全国12个省份的22种桑叶中的DNJ含量。与之前文献报道相比，对HPLC的流动相进行改进。采用梯度洗脱的方法，成功地将DNJ与桑叶提取物中其他干扰物质分离开，从而避免这些组分对定量结果的影响。在2.02～40.50 μg/ml范围内，线性回归方程为y=2 220 591x-1 587 898，R2為0.999 1，方法的检测限、定量限分别为0.15、0.50 μg/ml，对样品进行加标回收试验，回收率范围为93.73%～97.91%。方法学研究表明，该方法的精密度、准确度令人满意。这种改进的HPLCFLD法能够精确地测定桑叶中DNJ含量，为建立DNJ的质量标准检测提供可靠的分析方法，也可以为开发降血糖药用桑树资源提供技术支持。

参考文献

[1] LEMBCKE B，FLSCH U R，CREUTZFELDT W.Effect of 1deoxynojirimycin derivatives on small intestinal disaccharidase activities and on active transport in vitro[J].Digestion，1985，31（2/3）：120-127.

[2] NOJIMA H，KIMURA I，CHEN F J，et al.Antihyperglycemic effects of Ncontaining sugars from Xanthocercis zambesiaca，Morus bombycis，Aglaonema treubii， and Castanospermum australe in streptozotocindiabetic mice[J].Journal of Natural Product，1998，61（3）：397-400.

[3] FENOUILLET E，PAPANDROU M J，JONES I M.Recombinant HIV envelope expressed in an alphaglucosidase Ideficient CHO cell line and its parental cell line in the presence of 1deoxynojirimycin is functional[J].Virology，1997，231（1）：89-95.

[4] SUNKARA P S，BOWLIN T L，LIU P S，et al.Antiretroviral activity of castanospermine and deoxynojirimycin，specific inhibitors of glycoprotein processing[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1987，148（1）：206-210.

[5] TSURUOKA T，FUKUYASU H，ISHII M，et al.Inhibition of mouse tumor metastasis with nojirimycinrelated compounds[J].The Journal of Antibiotics，1996，49（2）： 155-161.

[6] KIM J W，KIM S U，LEE H S，et al.Determination of 1deoxynojirimycin in Morus alba L.leaves by derivatization with 9fluorenylmethyl chloroformate followed by reversedphase highperformance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography A，2003，1002（1）： 93-99.

[7] KIMURA T，NAKAGAWA K，SAITO Y，et al.Determination of 1deoxynojirimycin in mulberry leaves using hydrophilic interaction chromatography with evaporative light scattering detection[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（6）： 1415-1418.

[8] NUENGCHAMNONG N，INGKANINAN K，KAEWRUANG W，et al.Quantitative determination of 1deoxynojirimycin in mulberry leaves using liquid chromatographytandem mass spectrometry[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007，44（4）： 853-858.

[9] RODRGUEZSNCHEZ S，HERNNDEZHERNNDEZ O，RUIZMATUTE A I，et al.A derivatization procedure for the simultaneous analysis of iminosugars and other low molecular weight carbohydrates by GCMS in mulberry （Morus sp.）[J].Food Chemistry，2011，126（1）： 353-359.

[10] 歐阳臻，陈钧，李永辉，等.柱前衍生化高效液相色谱荧光检测法测定桑叶中的1脱氧野尻霉素[J].分析化学，2005，33（6）：817-820.