腈水解酶的特性与应用进展研究

肖婧　常雁红　罗晖

摘要 腈水解酶是一种能将腈类物质水解为相应羧酸的酶，具有广泛的底物适应性，并且能高效催化单一的反应，拥有优良的选择性。它在有机合成、降解腈类化合物以及环境治理等方面中表现出巨大应用潜力。该研究论述了腈水解酶的来源、特性以及其应用方面的进展研究。

关键词 腈水解酶；催化特性；固定化；应用进展

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-019-04

Abstract Nitrile hydratase is a kind of material can be hydrolyzed to the corresponding carboxylic acid nitriles enzyme.It has a broad substrate adaptability，and can catalyze the reaction of single，has excellent selectivity to show potential application in organic synthesis，degradation of nitrile compounds and environmental governance aspect.This paper discusses the source，nitrilase characteristics as well as its application research progress.

Key words Nitrilase； Catalytic characteristics； Immobilization； Application progress

1 腈水解酶概述

1.1 简介

腈水解酶（EC 3.5.5.1）又称腈酶，属于腈代谢酶系中的一种，是重要的工业用酶，也是重要的生物催化剂。它能够水解碳氮肽键来生产更加有价值的相对应的羧酸[1-2]。腈的化学水解通常需要高温强碱性或酸性的条件，易产生不必要的副产物和大量的无机废物。而利用腈水解酶催化水解生成羧酸，是通过一步反应进行的，体现出优越的高选择性、高效率以及环境经济性，为降解腈类物质提供了一个“绿色”的选择。到目前为止，腈水解酶被广泛用于精细化学品、医药中间体的生产以及腈污染物的生物修复。

1.2 来源

1.2.1 天然腈水解酶的来源。

在自然界中，几乎所有的真菌、植物以及动物等有机体的体内都会产生脂肪腈或芳香腈如氰脂、蓖麻碱和苯乙腈等。这些腈类化合物不仅能够提供生物必须储备氮源，而且能够起到保护作用，免受其他生物的侵害[3]。

1935年，有学者提出某些植物组织自身能将腈类化合物转化成羧酸。这些酸类物质对植物生长有利，从而论证某些有机羧酸、酰胺等腈类衍生物有助于植物的生长。20世纪60年代，Thimann等得到一种类似化学法能够水解腈或酰胺的酶。它是从大麦叶子中提取、纯化的。该酶能将3吲哚乙腈水解成为吲哚3乙酸，故将其命名为吲哚乙腈水解酶[4]。随着研究的不断深入，他们发现这种吲哚乙腈水解酶不仅能水解3吲哚乙腈，而且对其他20余种脂肪族和芳香族的腈类化合物都具有催化活性，例如该酶水解底物3氰基吡啶的活力比水解3吲哚乙腈高接近10倍。因此，Thiman等给这种酶赋予一个新的名称——腈水解酶。

历史上第一次发现能产腈水解酶的微生物菌种的是Hook和Robinson。他们在假单胞菌（Pseudomonas）中利用蓖麻碱天然腈筛选所得到的。该菌水解3氰基吡啶的能力提高1倍[5]。之后，又有许多研究者从微生物和植物中用特定的方法筛选出各种产腈水解酶。目前为止，发现的能产腈水解酶的有机生物体主要有假单胞菌属（Pseudomonas）、枯草芽孢杆菌属（Bacillus）、红球菌属（Rhodococcus）、不动杆菌（Acinetobacter）、臭鼻杆菌（Klebsiella ozaenae）、粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）、黑曲霉菌（Aspergillus niger）、镰刀菌（Fusarium solani）[6-8]。可见，腈水解酶主要分布在细菌中。

1.2.2 新型腈水解酶的来源。

传统用作降解腈化物的腈水解酶大部分均为野生型菌株，但是其收益率和催化特性较低，通常不能满足工业生产的需求，因此利用重组表达酶是一个不错的途径[8-10]。由于大肠杆菌的繁殖增长速度快，遗传特征明显，大肠杆菌是小规模的重组酶表达的最常用的宿主细胞。然而，在自然界中所发现的微生物中的腈水解酶99%以上是不能够被培养的，可培养获得的微生物占总数的不足1%，同时腈水解酶在应用上的局限性也阻碍其发展，故寻找新型腈水解酶且能够提高其应用性能的研究受到越来越多学者的关注。宏基因组学技术通过提取特定环境样品中的微生物总基因组、构建小片段文库，从中筛选和挖掘功能基因。随着后基因组时代的到来，基因挖掘技术也逐步受到重视。该技术主要根据实际需要，有针对性地选取某个具有代表性的探针酶为模板，在数据库中进行对比和搜索，深入挖掘具有序列或结构同源性的酶基因，尤其是从未获得表征或报道的基因，进而可通过设计特异性引物从目标物种扩增该编码基因且重组表达。Kaplan等[11]从粗糙链孢霉、产黄青霉、小麦赤霉病念珠和玫瑰色红球菌中，利用基因挖掘技术，培养出新型腈水解酶，并且能够用于3氰基吡啶、4氰基吡啶和溴苯腈等工业上重要底物的转化。由于基因数据资源相当丰富，宏基因组技术和基因组挖掘成为新兴领域，在未知基因组数据库中的信息和自然环境不可培养微生物中为寻找更多有应用价值的新型腈水解酶提供了前所未有的机遇。

2 腈水解酶催化特性

2.1 催化机理 按微生物对腈的分解性质，可分为腈水解酶和腈水合酶两种酶[12]。腈水解酶直接催化水解腈类化合物，一步直接生成相应的羧酸和氨（RCN+2H2O→RCOOH+NH3↑）[13]，然而腈水合酶催化水解腈类化合物生成相应的酰胺（RCN+H2O→RCONH2），接着酰胺在酰胺酶的作用下水解生成羧酸和氨[14]。因此，在对腈类化合物作用机理中，腈水解酶和腈水合酶/酰胺酶双酶有显著区别。根据氨基酸的同源性，腈水解酶属于腈水解酶超家族。一种新型的谷氨酸赖氨酸半胱氨酸（GluLysCys）的催化三联体被认为是腈水解酶的活性位点，也是整个腈水解酶超家族中的催化残基部分。它分布在αββα三明治型酶蛋白折叠上[15]。由于底物能和位于催化三联体半胱氨酸上的巯基反应形成共价键，生成巯基酶共价结合的中间体，从而直接形成羧酸。腈水解酶的活性部位[16]没有金属离子，所以大部分金属离子和金属离子螯合劑如乙二胺四乙酸、柠檬酸、聚乙烯酸等不会影响酶的活性，但有些能够与巯基反应[17]的离子如银离子与汞离子等对酶活力有很强的抑制作用。

2.2 游离腈水解酶的催化特性

正是由于腈水解酶拥有优异的化学性质、区域选择性以及立体选择性，目前已受到越来越多学者的研究和关注[18]。腈水解酶具有催化效率高、操作温和可控、经济成本低、环境污染小等优点，是降解腈类物质的一种“绿色”的选择。通过利用腈水解酶来水解腈类物质，能够获得很多化学法难以得到或产率较低的有机羧酸类产物，因此腈水解酶的研究与应用具有巨大的潜力[19]。

然而，许多已知的腈水解酶具有稳定性差的劣势。首先是腈水解酶的温度稳定性。许多研究表明，腈水解酶对高温的耐受性弱。在低温条件下，酶的活性会随着温度的增加而增强，其稳定性基本不变；但是，当温度高于最适宜的温度时，酶的结构会被破坏，酶活反而下降[20]。李恒等[21]用恶臭假单胞菌腈水解酶进行研究，发现腈水解酶在4、30、50 ℃下半衰期分别为240、150和1 h。其次是腈水解酶的pH稳定性。在酶促反应中，缓冲液的pH在一定程度会影响腈水解酶活性。腈水解酶催化水解有機腈类化合物应当在适宜的pH范围内反应。绝大多数腈水解酶的最适pH为7。过碱或过酸的条件都会对酶的结构造成破坏，影响其催化活性。这阻碍了腈水解酶的工业应用。有学者研究将游离的腈水解酶进行固定化，可以大大提高其稳定性[22-26]。

2.3 固定化腈水解酶的催化特性

由于腈水解酶在非常态条件下极其不稳定，游离酶不耐受搅拌器的高剪切力，难以从反应混合物过滤或离心恢复，因此有必要将腈水解酶进行固定化。酶或细胞的固定化不仅有利于提高酶的底物耐受性、热稳定性、操作稳定性以及储藏稳定性，保护酶或细胞免受有毒物质侵害，而且有利于产物的后续分离和反应连续处理等，减少游离酶或细胞恢复所消耗的昂贵过程[27]。细胞固定化的常规方法有微胶囊化、交联、吸附和包埋。到目前为止，关于固定化腈水解酶的报道很少，主要有采用壳聚糖固定化细菌、琼脂、海藻酸钠、二氧化硅、硅胶、聚丙烯酰胺和聚乙烯醇（PVA）。

Liu等[28]利用固定化重组大肠杆菌腈水解酶转化亚氨基二乙腈合成亚氨基二乙酸，其固定化酶的热稳定性、pH耐受性的范围都比游离酶的要广泛，在4 ℃储存30 d保持90%的酶活，而且其操作稳定性在重复利用9次之后仍保持35%的酶活。利用Streptomyces sp.MTCC 7546 细胞固定化后催化0.1 mol/L丙烯腈，连续使用 25 次，仍保持65%的初始酶活[29]。Zhen等[30]将Arthrobacter nitroguajacolicus ZJUTB 0699菌种的腈水解酶利用海藻酸钙包埋固定化后催化丙烯腈，在重复使用11次之后仍保持接近100%的初始酶活。张代晖等[31]将氨基与环氧基作为固定化载体，优化固定化条件，得出的结果是除了固定化的最适反应温度、pH以及热稳定性都优于游离酶，而且在催化过程中底物苯甘氨腈发生自消旋立体选择性强，固定化酶所表现出来的催化效率高、产物构型单一等优良的性质能够满足工业催化的需求。

3 腈水解酶的应用进展研究

3.1 在有机合成中的应用

目前，利用腈水解酶合成有机羧酸的催化过程具有效率高、选择性强以及反应条件温和等优点，在工业生产中得到广泛的应用与关注。

瑞士Lonza公司是最早采用腈水解酶催化的方法在工业上生产B 族维生素烟酸，最近又研究筛选出一种新型的腈水解酶菌种。其工艺原理是，利用腈水解酶和烟酰胺脱氢酶的共同作用，将底物2氰基吡啶与2氰基吡嗪分别降解为合成药物中间体5羟基吡啶2甲酸与5羟基吡嗪2甲酸，其反应选择性强，转化率接近100%，对比传统物理化学方法有极大的优势[32]。

一种重要的有机酸（R）扁桃酸在医药上广泛用于环扁桃酸酯、头孢羟唑、羟苄唑、匹莫林等药物合成中间体[33]。德国BASF公司的工艺原理是：第一步是苯甲醛和氢氰酸反应生成外消旋扁桃腈，其次是优化反应条件，再者经过腈水解酶选择性拆分，最后得到产物（R）扁桃酸。

另一种重要的工业化学品羟基乙酸，又名乙醇酸（glycolic acid），是最简单的α羟基酸。羟基乙酸在化妆品、黏合剂、金属清洗、生物降解材料、染色、纺织等方面都有重要的工业应用价值。马金伟等从重组质粒pETNit出发，利用不同浓度的锰离子对腈水解酶基因进行易错PCR，并构建随机突变库。根据腈水解酶催化羟基乙腈可导致反应体系pH降低的特性，建立了简便的突变酶筛选方法。经过三轮的随机突变和筛选，从5 000多个克隆中筛选得到一株活性提高的突变菌BL21（DE3）/pETNit Mut3，其催化羟基乙腈的活力达到原始重组菌的5.3倍。

Zhang[2]等利用Acidovorax facilis通过一个关键氨基酸Phe168的定向改造，使得其产腈水解酶活性大大提高，进一步生产1（cyanocyclohexyl） 乙酸，产率达到90%。Rustler等[34]通过荧光假单胞菌合成腈水解酶转化扁桃腈和苯基甘氨腈。

Zhu等[35]利用恶臭假单胞菌cgmcc3830通过表征和功能克隆产芳香腈水解酶，高效地转化氰基吡啶。最近，Kaplan等已从黑曲霉菌和滕仓赤霉菌克隆和异源表达出真菌腈水解酶，能够直接地转化2氰基吡啶和3氰基吡啶。

3.2 在纺织品改性中的应用

腈水解酶催化在纺织品的改性方面具有很大的优势，其催化过程条件温和，反应可控性强，减少能量的消耗，节约能源。腈水解酶不但能改善纺织物的外观，还能使其手感变得更加舒适，而且作为一种酶，也是一种蛋白质，无毒，可降解，比醇、醛、酸、酯等化工原料更环保。腈纶分子结构很独特，呈不规则的螺旋形构象。腈水解酶酶对腈纶上腈基的水解只是纤维表面，不影响纤维主体构造，因此可以保留腈纶原有柔软蓬松的物理机械性能，也不用担心被腈水解酶水解后纺织物的抗撕抗拉性下降[3]。

王宁等[36]为提高腈水解酶对腈纶纤维的生物酶改性效果，根据“相似者相容”的原理，选用有机溶剂预处理方法。利用有机溶剂对腈纶纤维表面产生的膨化、塑化作用，提高腈水解酶的水解能力，最大化地提高腈纶纤维的表面改性效果。试验结果验证了利用苯甲醇预处理和腈水解酶催化后的腈纶纤维的吸湿性和抗静电性的能力测试上均得到较大幅度的提高。

3.3 在抗腈类农药作物的应用

农药在治理农业和林业的病虫害过程中起至关重要的作用，但是过度使用农药以及农药残留会给农林作物带来严重的危害，造成环境污染。现在利用微生物生物修复技术来降解农药残留是学者研究的热点。这是因为与物理化学的降解方式相比，利用微生物降解速度快，成本低，操作简单，不会产生二次污染，成为解决农药问题的经济、安全、有效的方法[37]。目前，最新的研究方向是利用基因工程手段改造腈水解酶菌种，增加其适应环境的能力，从根本上提高微生物降解效率[38]。

氯苯腈、溴苯腈以及碘苯腈都是常用的除草剂。它们在土壤和植物里残留时间很长。如果不对这些残留的除草剂等农药进行降解处理，那么会严重影响农林作物的生长。

有研究人员[39]从土壤细菌K.ozaenae中分离出溴苯腈的降解基因（bxn）。该基因能够编码且产生腈水解酶，使得溴苯腈水解成为一种没有毒性的非除草剂，名为3，5二溴4羟基苯甲酸，再将这种基因植入棉花基因中，从而得到一种能够抗溴苯腈的转基因植株。近来，中国农业科学院棉花研究所和中国科学院上海植物生理研究所共同研究，利用花粉管通道法将抗溴苯腈的bar基因植入我国主要栽培棉花基因中，获得实践性的成果[1]。

3.4 在含腈废水中的应用

含腈废水是指含有腈类（-CN基团）的工业废水，主要来自化工、选矿、合成橡胶、纤维和染料等工业生产过程所排出的污水。有机腈类物如乙腈、丙腈、丙烯腈和丁腈等在工业生产过程中排放，其气味刺激性强，毒性大，且难以自然沉降和生物降解。如果直接排放，则会对环境、动植物和生态系统造成严重的危害[40]。

含腈废水的处理方法通常有化学处理法、生化处理法以及物化处理法。但是，这些方法都需要非常苛刻的条件如强酸、强碱、高温、高压，造成设备腐蚀严重，而且伴随产生的副产物通常具有腐蚀性和毒性，会产生严重的环境污染[2]。为避免物理法和化学法产生的不利因素，现在越来越多的学者采用生物酶的方法降解腈类物质，腈水解酶催化过程温和可控、生成副产物少、环境污染小以及优异的化学、区域和立体选择性。

利用腈水解酶降解腈类化合物的特性，在含腈废水中投加一定量的产腈水解酶菌株，使其发展成为优势菌群，接着便能将腈类物质降解为相应的羧酸，达到环境治理的目的。由此看来，利用腈水解酶或产腈水解酶的微生物处理含腈废水，具有很大的发展潜力。目前，已有学者利用全细胞腈水解酶降解废水中的聚合丙烯腈，而且达到很好的效果[41]。与传统的物理化学法相比，腈水解酶法处理含腈废水，具有高效性、经济性以及环境污染小等优点。

4 结语

腈水解酶是酶超家族中的一个最重要的酶，能夠将有毒的腈直接转化成无毒、应用价值高的酸。近年来，它越来越受到人们的重视，主要应用在化学工业中羧酸的合成以及在纺织工业中的聚合物表面改性和含在污染处理过程腈降解污染物。

虽然腈水解催化性能已被发掘到一定程度，但因其有限的催化效率和运行稳定性而使其在工业应用基本上还未开发。这些缺点可以通过基因表达和进一步的分子修饰或体外进化克服。此外，探索新的腈水解酶资源及其应用已成为研究热点。

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