N,N-二(2-羧基苯基)-2,6-吡啶二甲酰胺与牛血清白蛋白作用的荧光光谱研究

王彩荣， 王璟琳， 李 敏， 王 丹

(长治学院化学系，山西长治 046011)

血清白蛋白(SA)是动物体内的输送蛋白，具有贮运内源代谢产物和外源小分子等重要生理功能，能和许多内源性和外源性的物质可逆结合。利用各种方法从不同角度考察SA与外源小分子之间的相互作用，已经引起了生命科学、化学、药学及临床医学科研工作者的普遍关注[1]。

酰胺基在自然界中广泛存在，是蛋白质结构中不可缺少的组成部分。由于酰胺基既能作为氢键给体(-NH-)，又能作为氢键受体(-C=O)广泛地形成氢键，因此许多酰胺类化合物被设计成为高选择性的人工受体，广泛地用于分子识别[2]，成为配位化学的一个重要的配体的构造单元。将吡啶基与酰胺基组装在同一配体中不仅能增加有机配体的功能性，而且通过各种氢键作用容易得到结构新颖和特殊功能的配合物[3 - 5]，但将它们应用到模拟生命体的研究报道并不多见。本文采用荧光光谱法，研究了酰胺类化合物N,N-二(2-羧基苯基)-2,6-吡啶二甲酰胺(BCPD)与牛血清白蛋白(BSA)在不同温度时的相互作用。证明了两者相互作用的机理，并进一步求得猝灭常数、结合常数及结合位点数等重要信息，为进一步深入展开BCPD在生物体内的相关研究提供一定科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

F-4600型荧光分光光度计(日本，日立公司)；U-3900型紫外分光光度仪(日本，日立公司)。

N,N-二(2-羧基苯基)-2,6-吡啶二甲酰胺参照文献方法[6]合成；牛血清白蛋白(分子量68 000，北京奥博星生物技术有限公司)，用pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液配成1.0×10-4mol·L-1储备液；其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

BCPD的荧光光谱测定：在室温条件下，以pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液为介质，用1 cm吸收池，溶液浓度为8.0×10-5mol·L-1；荧光激发波长λex=355 nm，激发狭缝宽Wex=5 nm，发射狭缝宽Wem=10 nm。

荧光滴定：固定激发波长λex=280 nm，激发、发射狭缝宽Wex=Wem=2.5 nm，水浴恒温，在250～500 nm范围内用F-4600型荧光分光光度计进行测定。

2 结果与讨论

2.1 BCPD的光谱性质

图1为BCPD在pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中的紫外吸收光谱。从图可知BCPD在300 nm附近有一宽吸收峰，归属于分子中羰基(C=O)的n-π*的跃迁。图2为在选定荧光光谱测定条件下，Tris-HCl缓冲溶液中BCPD的荧光发射光谱。从图中可以看出BCPD的发射峰为一宽峰，相对荧光强度较弱，最大发射在405～425 nm之间，属于芳环的π*-π跃迁。该发射峰的位置不会影响2.2节中BSA的荧光滴定结果。

图2 室温下pH=7.4 Tris-HCl中BCPD的荧光光谱

图3 Tris-HCl体系中BCPD滴定BSA的荧光光谱

2.2 BCPD对BSA的荧光滴定光谱

在荧光池中加入1.0×10-4mol·L-1BSA溶液10 μL，并用0.5 mol·L-1的pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液稀释至2 mL。在λex=280 nm，Wex=Wem=2.5 nm条件下，取一定体积BCPD(8.0×10-4mol·L-1)溶液对体系进行滴定。荧光滴定结果如图3。图中BSA的荧光发射峰值位于320 nm处，随着BCPD的不断滴加，BSA的荧光发生规律性猝灭，且在BCPD浓度较高时发生轻微红移，表明BSA的内源荧光被BCPD猝灭，红移的原因可能是BCPD的加入使蛋白质的骨架更加伸展所致。

2.3 荧光猝灭机理

荧光猝灭有动态猝灭和静态猝灭两种，无论动态猝灭过程还是静态猝灭过程，加入猝灭剂前后的荧光强度的比值F0/F与猝灭剂的浓度[Q]均呈线性关系，随温度的升高动态猝灭常数增大，而静态猝灭常数减小，以此判断荧光猝灭类型[7]。

测定了温度分别为291 K、296 K、301 K和306 K时BCPD对BSA的荧光滴定光谱，根据Stern-Volmer方程，以F0/F对[Q]作图，得到BCPD对BSA作用的Stern-Volmer曲线，以此求得对应温度下的Stern-Volmer方程及KSV、Kq值，列于表1中。结果表明，不同温度下的曲线线性关系较好，而且随着温度的升高，直线的斜率(即猝灭常数)增大，表明BCPD对BSA的荧光猝灭过程为动态猝灭。由于生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2.0×1010L·mol-1·s-1，生物大分子的荧光寿命约为10-8s[8]。在实验温度下Kq数量级均为1012，由此判断该体系的猝灭机理似乎应归为静态猝灭，但实验体系为离子溶液，离子强度是影响猝灭系数的重要因素，推测猝灭常数的增大是由于体系离子强度影响的结果[9]。

表1 不同温度下BCPD对BSA的线性及相关参数方程

2.4 结合常数及结合位点数

在猝灭过程中，假如生物分子有n个相似的独立结合位点，荧光物质与猝灭剂之间的结合常数KA和结合位点数n间的关系可由下式[10]得到：log[(F0-F)/F]=logKA+nlog[Q]。式中，F0、F分别为猝灭剂加入前后体系的荧光强度，KA为结合常数，[Q]t为加入猝灭剂的总浓度，n为结合位点数。

以log[(F0-F)/F] 对log[Q]作图，由直线的斜率和截距求得不同温度下的结合位点数n和结合常数KA见表2。表2中结合位点数n都接近于1，说明体系中BCPD与BSA形成了1∶1的复合物。结合常数KA在105～106数量级，说明两者为一强相互作用。

2.5 BSA与BCPD结合反应的热力学性质及作用类型判断

当温度变化不大时结合反应的焓变△H可以看作一个常数，根据公式：lnK=-△H/RT+△S/R，△G=△H-T△S=-RTlnK，求出了在不同温度下的热力学常数，结果列于表2。

根据Rossn等[11]总结出的判断生物大分子与小分子结合力性质，及生物大分子自身结合力性质的热力学规律，可以判断BCPD与BSA之间的作用力以疏水作用为主。

表2 不同温度下BCPD和BSA的结合常数和结合位点数及热力学常数

3 结论

采用荧光光谱法，在不同温度下研究了N,N-二(2-羧基苯基)-2,6-吡啶二甲酰胺(BCPD)与牛血清白蛋白(BSA)在pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中的相互作用。荧光滴定结果表明，体系的猝灭常数KSV随温度的升高而增大，BCPD对BSA的内源荧光猝灭机理为动态猝灭，两者间结合位点数约为1；测得四个不同温度下的平均结合常数为3.82×106L·mol-1；热力学参数表明两者之间结合的作用力主要为疏水作用。