蜂王浆中脂肪酸的高效液相色谱-质谱法检测

刘善菁，陈 磊，张 睿，吴 斌，陈惠兰，张晓燕，费晓庆，杨功俊*

（1.中国药科大学药学院，南京211198；2.江苏出入境检验检疫局食品实验室，南京210001）

蜂王浆中脂肪酸的高效液相色谱-质谱法检测

刘善菁1，陈 磊2，张 睿2，吴 斌2，陈惠兰2，张晓燕2，费晓庆2，杨功俊1*

（1.中国药科大学药学院，南京211198；2.江苏出入境检验检疫局食品实验室，南京210001）

建立了一种高效液相色谱 四级杆/飞行时间质谱法检测蜂王浆中6种脂肪酸.样品经水溶液溶解和甲醇沉淀蛋白后，以C18反相色谱柱为分析柱，乙腈和φ（甲酸）=0.1%的水溶液为流动相，通过梯度洗脱对8-羟基辛酸、10-羟基-2-癸烯酸、癸二酸、10-羟基癸酸、2-十二碳烯二酸和十二烷二酸等6种脂肪酸进行分离，并采用四级杆/飞行时间质谱检测器对其进行定性和定量分析.定量分析结果显示，方程线性相关系数（r2）为0.997 5～0.999 7，定量限为0.10～1.0 mg·L-1，检出限为0.050～0.20 mg·L-1，加标回收率为82.9%～107.0%，相对标准偏差为0.9%～4.9%.用该方法对采自我国不同地区137份蜂王浆样品进行分析，初步确定合格蜂王浆中10-羟基-2-癸烯酸、10-羟基癸酸和8-羟基辛酸3种脂肪酸的含量，并建议在现行国家标准的基础上增加10-羟基癸酸和8-羟基辛酸作为蜂王浆质量评价的指标.

蜂王浆；10-羟基-2-癸烯酸；10-羟基癸酸；8-羟基辛酸；四级杆 飞行时间质谱；液相色谱

蜂王浆（royal jelly）是工蜂咽下腺和上颚腺分泌的浆状物质［1］.蜂王浆中含有蛋白质、氨基酸、糖类、脂肪酸及维生素等物质［2-3］，具有抗氧化［4］、抗癌［5］、抗菌［6］、免疫［7］等多种生理活性.蜂王浆中的脂肪酸是其生理活性的主要来源.中国现行国家标准中以10-羟基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA）作为判断蜂王浆质量的唯一活性成分指标，然而蜂王浆中含多种脂肪酸，仅用10-HDA作为质量判断依据显得单一，因此对蜂王浆中脂肪酸类物质的组成及含量进行研究具有一定的意义.衍生化处理技术是目前色谱法中常用技术之一，扩展了色谱法的应用范围［8］.目前，对蜂王浆中脂肪酸类物质组成及含量测定的研究并不多见，已报道的检测方法主要是气相色谱-质谱联用法［9-11］，但样品须经衍生化处理，且只能测定蜂王浆中各脂肪酸在总脂肪酸中的比例，加之检测样本较少，不能代表整体情况，目前尚未有液相色谱-质谱联用法检测蜂王浆中脂肪酸的文献报道.本文建立了一种快速、高效的液相色谱-四级杆/飞行时间质谱法，用于测定蜂王浆中8-羟基辛酸、10-HDA、癸二酸、10-羟基癸酸、2-十二碳烯二酸和十二烷二酸等6种含量较高的脂肪酸，并对采自我国不同地区的137份蜂王浆样品进行分析.

1　实验部分

1.1仪器与试剂

1200高效液相色谱仪、6530四级杆/飞行时间质谱检测器（美国Agilent公司）；ELGA-Q15高纯水发生器（英国ELGA公司）.

甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，美国Anaqua公司）；实验用水均为去离子水.

标准物质：10-HDA标准品（日本Alfresa Pharma公司）；10-羟基癸酸、8-羟基辛酸标准品（AdamasReagent中国分公司）；癸二酸、2-十二碳烯二酸、十二烷二酸标准品（日本东京化成工业株式会社）.

标准溶液的配制：精确称取各标准品10.0mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成1.0g·L-1标准液，在4℃条件下密封保存.使用前用甲醇 水（体积比为1∶1）混合溶液将其稀释成系列标准工作溶液.

实验中所用蜂王浆样品来自于江苏、安徽、湖北、浙江、山东、山西、陕西等地，主要植物来源为油菜、洋槐、荆条、椴树等.

1.2仪器条件

1）色谱条件.色谱柱为EclipsePlusC18（2.1mm×100mm，1.8μm；美国Agilent公司），流速为0.2mL·min-1，进样体积为5μL，流动相A为乙腈，流动相B为φ（甲酸）=0.1%的水溶液.

梯度洗脱程序：B的体积分数在0～1.0min保持75%不变；1.0～1.1min，从75%快速降至70%；1.1～3.0min，保持70%不变；3.0～6.0min，从70%线性降至50%；6.0～10.0min，保持50%不变；10.0～10.1min，从50%快速升至75%；10.1～15.0min，保持75%不变.

2）质谱条件.电喷雾离子源（ESI）；负离子模式；雾化气压力：310kPa；干燥气温度：325℃；干燥气流速：5L·min-1；毛细管电压：3000V；高分辨质谱全扫描模式扫描范围：m/z=100～1000；TargetMS/MS模式扫描范围：m/z=25～250；碰撞解离电压：135V；鞘气温度：400℃；鞘气流速：12L·min-1.

1.3样品前处理

准确称取0.5g蜂王浆样品于50mL塑料离心管中，加入2mLφ（甲酸）=0.5%溶液，形成均匀乳白色悬浊液.再加入甲醇18mL，涡旋30s，超声15min，在4℃和8000r·min-1条件下离心5min.取200μL上层清液，加入300μL甲醇及500μL水于1.5mL塑料离心管中混合混匀，经0.45μm有机相及水相滤膜过滤至进样瓶中，供高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱仪测定使用.

2　结果与讨论

2.1前处理条件的优化

比较了4种不同溶液对蜂王浆中脂肪酸的提取效果：A.甲醇；B.乙腈；C.φ（甲酸）=0.5%溶液与甲醇（体积比1∶9）；D.φ（甲酸）=0.5%溶液与乙腈（体积比1∶9）.按1.3项步骤处理，结果显示，不同溶液中6种脂肪酸的峰面积由大到小的次序为C，A，D，B，说明采用提取液C提取蜂王浆中脂肪酸和沉淀蛋白可获得较高的响应.

2.2流动相的选择

在初始流动相条件下，当流动相中的有机相采用乙腈时，柱压为22.4MPa，而采用甲醇时柱压则为28.1MPa，约增加25%，因而采用乙腈作为有机流动相可有效降低柱压，保护进样系统.对流动相中的水相而言，实验结果表明：当采用纯水作为流动相时，6种脂肪酸峰形拖尾、分叉，峰展宽严重；而采用φ（甲酸）=0.1%的水溶液时，6种脂肪酸均能获得良好的峰形和分离效果；因此，本研究选择乙腈和φ（甲酸）=0.1%的水溶液分别作为流动相中的有机相和水相.

2.36种脂肪酸的定性分析

1）高分辨全扫描模式下的定性分析.将处理好的蜂王浆样品进样，在全扫描模式下得到高分辨一级质谱图.根据6种脂肪酸的分子式，提取得到6种脂肪酸的提取离子流色谱图，提取精度设为2×10-5（见图1）.将提取得到的结果与标准品进行比对，结果表明样品中6种脂肪酸的保留时间与标准品均一致.利用MassHunter软件对样品中测得的6种脂肪酸的精确质量数进行计算，得到各化合物质荷比偏差（见表1），结果显示，样品中各化合物实际测得的精确质量数与理论值偏差均小于4×10-6.

图1　全扫描模式下6种脂肪酸的提取离子流色谱图Fig.1 Extracted ion chromatography of 6 fatty acids under full mass scan mode

表1　6种脂肪酸的分子式、分子离子峰理论质荷比、实测质荷比、偏差及保留时间Tab.1 Molecular formula，theoretical mass-to-charge ratio，accurate mass-to-charge ratio，diffs and retention time of 6 fatty acids

2）Target MS/MS模式下的定性分析.为了进一步对化合物进行确证分析，在Target MS/MS模式下，通过优化碰撞电压，分别得到了各化合物标准品与蜂王浆样品中强度较大的2种子离子的质荷比数据（见表2）.结果表明，各化合物标准品与样品子离子的质荷比偏差均小于1×10-5，实现了对样品中6种脂肪酸的确证分析.

表2　6种脂肪酸子离子精确质荷比及偏差Tab.2 Target MS/MS parameters，accurate mass-to-charge ratio and deviations of product ions of 6 fatty acids

综合高分辨全扫描模式与Target MS/MS模式下得到的标准品与样品中6种脂肪酸分子离子峰精确质荷比、子离子精确质荷比及各化合物的保留时间，可以确证蜂王浆样品中确实含有8-羟基辛酸、10-HDA、癸二酸、10-羟基癸酸、2-十二碳烯二酸和十二烷二酸等6种脂肪酸类化合物.

2.46种脂肪酸的定量分析及方法学考察

1）线性范围、线性方程、相关系数、定量限及检出限.分别配制各化合物不同浓度的系列标准溶液，以分子离子峰的峰面积y对样品浓度x/（mg·L-1）进行回归计算，得到各化合物的标准曲线，相关参数见表3.

表3　6种脂肪酸线性范围、线性方程、相关系数、定量限及检出限Tab.3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients（r2），limits of quantitations（LOQs）and limits of detections（LODs）of 6 fatty acids

2）回收率及精密度.取1份蜂王浆样品作为基质，按1.3项样品前处理进行加标回收率实验，分别测定3个不同质量比样品的回收率，每个水平平行测定5次，结果见表4.数据显示，6种脂肪酸的回收率在82.9%～107.0%之间，相对标准偏差在0.9%～4.9%之间，可满足样品分析要求.

表4　6种脂肪酸回收率与相对标准偏差（n=5）Tab.4 Recoveries and relative standard derivations of 6 fatty acids in royal jelly（n=5）

2.5蜂王浆样品检测

现行国家标准GB9697—2008中规定，蜂王浆中w（10-HDA）≥1.4%为合格品.应用本文的方法对来自我国不同地区的137份蜂王浆样品中6种脂肪酸含量进行了测定，并依据国家标准规定以10-HDA含量为依据，对137份样品进行质量评价.其中，合格品为83个，不合格品为54个.此外，分别对合格品和不合格品中除10-HDA外的5种脂肪酸进行统计，结果如表5所示.

表5　蜂王浆合格与不合格样品中5种脂肪酸的含量（n=137）Tab.5 Contents of 5 fatty acids in qualified and unqualified royal jelly samples（n=137）

根据137份蜂王浆样品的测定结果，可得出如下结论：① 蜂王浆中10-HDA、10-羟基癸酸、癸二酸以及8-羟基辛酸含量较高，合格品中其质量分数均大于0.1%；②10-羟基癸酸和8-羟基辛酸的质量分数在合格品和不合格品中有显著性差异（P＜0.05），建议将其增加为蜂王浆质量评价的新指标.根据本实验中测定的137个样本，可初步确定在合格蜂王浆中3种脂肪酸的含量须符合以下标准：w（10-HDA）≥1.4%，w（10-羟基癸酸）≥0.487%，w（8-羟基辛酸）≥0.110%.

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Determination of fatty acids in royal jelly by liquid chromatography-mass spectrometry

LIU Shanjing1，CHEN Lei2，ZHANG Rui2，WU Bin2，CHEN Huilan2，ZHANG Xiaoyan2，FEI Xiaoqing2，YANG Gongjun1*
（1.Sch of Pharm，China Pharm Univ，Nanjing 211198，China；2.Lab of Food，Jiangsu Entry-Exit Inspec&Quarant Breau，Nanjing 210001，China）

A liquid chromatography-quadrupole/time of flight mass spectrometry method was developed for determination of 8-hydroxyoctanoic acid，10-hydroxy-2-decenoic acid，sebacic acid，10-hydroxydecanic acid，2-dodecenedioic acid，dodecanedioic acid in royal jelly.The samples were dissolved in formic acid solution and deproteinized by methanol.C18reversed phase column was used for separation with acetonitrile andφ（formic acid）=0.1%solution as mobile phase by gradient elution program.The electrospray ionization was operated in negative mode.Full mass scan and target MS/MS in high resolution mode were used in qualitative and quantitative analysis.Under the optimum conditions，the 6 fatty acids performed good linearity with correlation coefficient（r2）of 0.997 5～0.999 7.The limit of quantitation（LOQ）and limit of detection（LOD）limits were in the range of 0.10～1.0 mg·L-1and of 0.050～0.20 mg·L-1，respectively.The average recoveries of 6 fatty acids were in the range of 82.9%～107.0% with relative standard deviations of 0.9%～4.9%.The method has been used to analyze 137 royal jelly samples from different area of China and the contents of 8-hydroxyoctanoic acid，sebacic acid and 10-hydroxydecanic acid in these samples were determined.The contents of 10-hydroxydecanic acid and 8-hydroxyoctanoic acid were suggested as supporting parameters for quality evaluation of royal jelly based on the current national standards.

royal jelly；10-hydroxy-2-decenoic acid；10-hydroxydecanic acid；8-hydroxyoctanoic acid；quadrupole/time of flight mass spectrometry；high performance liquid chromatography

O 657.63；S 896.3

A

1007-824X（2015）02-0040-05

（责任编辑 秋 实）

2014-12-07.*联系人，E-mail：gjyang@cpu.edu.cn.

国家自然科学基金资助项目（21275162）；江苏省“青蓝工程”资助项目.

刘善菁，陈磊，张睿，等.蜂王浆中脂肪酸的高效液相色谱-质谱法检测［J］.扬州大学学报：自然科学版，2015，18（2）：40-44.