antimiR-138 修饰骨髓基质干细胞膜片的可行性及其促进同种冻干骨粉成骨的研究

闫钧　赵彦涛　张京　吴琛　陈静园　张玉梅

antimiR-138 修饰骨髓基质干细胞膜片的可行性及其促进同种冻干骨粉成骨的研究

闫钧赵彦涛张京吴琛陈静园张玉梅

目的 探索采用非病毒方法转染骨髓基质干细胞 （bone mesenchymal stem cells，BMSC）膜片的可行性；antimiR-138 转染的 BMSC 膜片促进同种冻干骨粉 （FDB）成骨的可行性。方法 采用 Vc 连续诱导法培养 BMSC 膜片，通过调整 Lipofectamine 2000-miRNAs 载体复合物的用量及转染步骤对 BMSC 膜片进行转染；采用荧光体式及显微观察、miRNA-PCR 方法比较各组的转染效率的差异；通过大体观察、HE 染色和扫描电镜观察 BMSC 膜片的形态。将 BMSC 膜片 / FDB 复合物移植到裸鼠皮下，术后 4～8 周，分别采用 HE 和MT 染色对膜片的成骨能力进行评估。结果 荧光体式及显微结果表明 antimiR-138 可成功地转至 BMSC 膜片中，其中 150 nM 组对内源性 miR-138 的抑制率为 85%；体内异位成骨实验表明 antimiR-138 转染的 BMSC 膜片可显著促进并加速移植复合物的骨组织形成。结论 （1）通过对以 Lipofectamine 2000 为载体的转染复合物的用量及转染步骤进行优化，可以构建出具有较高转染效率，良好的细胞相容性以及结构完整的 antimiR-138修饰的 BMSC 膜片。（2）antimiR-138 转染的 BMSC 膜片可显著促进并加速移植复合物的异位骨组织形成。

间质干细胞；转染；MicroRNAs；移植，同种；骨生成；细胞膜片

细胞膜片技术是指在体外连续培养高密度接种的细胞，使其复层生长，形成一张富含细胞与细胞外基质的膜状结构，并采用非酶解的方式对其进行收获，因而可完整保存细胞膜表面蛋白、细胞-细胞连接、细胞-细胞外基质连接等，有利于细胞功能保存［1-2］，并且可将单张细胞膜片或将多张同种 /异种膜片，在体外进行三维叠加构建工程化组织或直接进行缺损修复［3］。目前细胞膜片技术已经被广泛应用于心脏［3-4］、皮肤［5］、角膜［6］以及牙周膜［7-8］等组织与器官的修复与再生研究，并且某些研究已经进入临床使用阶段。因此，基于其独特的保存细胞-细胞外基质以及细胞与细胞间信号分子、细胞利用率高和可塑性好等特性，细胞膜片技术已经成为现代再生医学的一个重要组成部分，并显示出巨大的临床应用前景。

干细胞的基因修饰是指将 DNA 或者 RNA 导入靶细胞内以改变其分化方向或分泌某种蛋白等，从而更好地发挥干细胞治疗和组织再生的功效［9］。研究发现，多种小分子核酸，包括 DNA，反义寡核苷酸，siRNA，miRNA 均可通过特定的途径转染到细胞中，发挥分子水平的治疗作用。目前常用的病毒载体虽可高效地转染多种细胞并长时间稳定表达目的基因，但是在临床上暴露出的免疫原性和致癌性等安全性问题，阻碍着它的进一步发展。非病毒载体不仅免疫反应低，而且具有易于体外合成、安全性高等优点，因而基因治疗的载体转运策略从病毒载体系统转移到了非病毒载体系统［10］。目前，尽管基因转染技术已在干细胞的基因修饰中得到广泛应用，然而将其用于细胞膜片的修饰却罕有报道，且局限于一些较复杂的方法，例如以磁珠修饰的病毒为载体并借助磁力对膜片进行转染［11-12］。因此，若要采用基因工程技术对细胞膜片进行修饰，以促进其向特定再生目标分化，就须寻找一种适用于细胞膜片转染的简单、实用的方法。

本研究以大鼠骨髓基质干细胞 （bone mesenchymal stem cells，BMSC）为种子细胞，采用 Vc 连续诱导法［13-14］培养 BMSC 膜片；以 antimiR-138 为代表，尝试采用非病毒转染试剂 Lipofectamine 2000对 BMSC 膜片进行转染，通过对其转染步骤加以优化，以期提高其在 BMSC 膜片中的转染效率，探索非病毒技术转染 BMSC 膜片的可行性。在此基础上，通过体内异位成骨实验评估 antimiR-138 修饰的BMSC 膜片 / FDB 复合体的促成骨能力。

材料与方法

一、主要材料和仪器

α-MEM 培养基 （Gibco BRL，Gaithersburg，MD，美国）；胎牛血清 （杭州四季青生物工程材料有限公司，浙江，中国）；L- 抗坏血酸 （Vc）（Sigma，Aldrich，美国）；LipofectamineTM2000 （Invitrogen，美国）；Opti-MEM （Gibco，美国）； miR-138 inhibitor（吉玛，上海）；miR-138 引物 （锐博，广州）；PrimeScriptTMRT reagent Kit 逆转录试剂盒 （Takara，大连）；SYBR Premix Ex TaqTMReal-time PCR 试剂盒（Takara，大连）；HERACELL 细胞培养箱 （Thermo，德国）；AIRTECH 超净工作台 （苏州净化设备厂）；倒置相差显微镜及照相系统 （BX50，Olympus Optical，日本）；倒置荧光显微镜 （Leica DMI6000B，Leica Microsystems，德国）；流式细胞仪 （FACScalibur，BD Biosciences，美国）；场发射扫描电子显微镜 （Hitachi S-4800；EIKO Engineering，日本）；实时定量 PCR 检测系统 （CFX96TM，Bio-Rad iQTM5，美国）。

1 周龄 SD 大鼠，4～6 周龄裸鼠均由第四军医大学实验动物中心提供。

二、BMSCs 的分离培养

将 SD 大鼠颈部脱臼处死，分离股骨和胫骨，冲洗出骨髓腔的内容物离心弃上清后，加入 10 ml 的α-MEM 培养基重悬，并接种于 75 cm2培养瓶中常规培养 72 h 首次换液，此后每 2 天换液 1 次，待细胞生长至覆盖培养瓶约 85% 时，0.25% 胰酶消化传代。第 1～2 代细胞用于本实验。

三、脂质体 miRNAs 载体的制备

本实验使用的 rno-antimiR-138-5p 以及其对照组 antimiR-contol 均由上海吉玛公司合成。根据前期研究结果［15］，本实验制备了四组不同浓度的 miRNA转染的载体混合物，具体配方见表1。

表1 Lipofectamine 2000-miRNAs 载体体系的配比 （μl）Tab.1 Transfection formulations of Lipofectamine 2000-miRNAs （μl）

四、antimiR-138 修饰的 BMSC 膜片的构建及形态学观察

首先将 P1 代的 BMSCs 以 3×105个 / 孔的密度接种到六孔板中，待细胞密度达到 100% 时，将板内的基础培养液更换为膜片诱导培养液 （10% FBS 的α-MEM+1% 青链霉素+50 μg / ml Vc），并连续培养6 天，每 2 天换 1 次液。第 7 天时更换板内液体为不含抗生素的膜片诱导液，第 8 天加入上述 4 种转染载体混合物，在常规培养条件下 （37 ℃，饱和湿度，5% CO2）孵育 24 h 完成转染，之后换膜片诱导液继续孵育 24 h 完成膜片构建。随后，分别采用体视显微镜观察膜片大体形态；场发射扫描电镜观察膜片的微观结构；HE 染色观察其组织学形态。

五、不同浓度 antimiR-138 修饰的 BMSC 膜片的转染效率

1. 不同浓度 antimiR-138 修饰的 BMSC 膜片的荧光体式观察：采用 Cy-3 标记 antimiR-138修饰 BMSC 膜片，于荧光体式显微镜下观察并采集图像。

2. 不同浓度 antimiR-138 修饰的 BMSC 膜片的荧光显微观察：采用 Cy-3 标记 antimiR-138 修饰BMSC 膜片，之后用细胞膜绿色荧光探针 （DIO）标记细胞膜，于荧光显微镜下观察并采集图像。

3. miRNA-qPCR 检测 antimiR-138 修饰的 BMSC膜片的转染效率：提取各组膜片的总 RNA，并测定 RNA 浓度，选择 RNA 溶液 A260 / A280 的比值在1.8～2.0 的样品用于后续的 PCR 检测。采用锐博公司的 miR-138 引物，Takara 公司的 PrimeScriptTMRT reagent Kit 逆转录试剂盒以及 SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒分别对 miRNA 进行反转录和 Real-time PCR 检测，通过公式 X=2-ΔΔCt计算各实验组的miRNA 138 经 U6 （内参）校正后相对于对照组的相对表达量。

六、细胞膜片 / FDB 复合体的体内成骨实验

当各组膜片形成后，将两层同样的膜片与 FDB骨粉复合 （图1），形成 BMSC 膜片 / FDB 复合体。选取 4～6 周龄 SCID 免疫缺陷鼠，0.1% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，消毒、铺巾，分别在左右前后两侧近四肢皮肤处剪开约 1 cm 的切口，稍作分离后，将三组 BMSC 膜片 / FDB 复合体植入裸鼠皮下，小针细线对位缝合。术后作好标记，继续清洁饲养4～8 周取材。移植复合体经多聚甲醛固定后 48 h EDTA 脱钙后 2～3 周脱水并石蜡包埋，组织切片进行 HE 染色及 Masson 三色染色。

图1 细胞膜片 / FDB 复合体的制备过程Fig.1 Fabrication of the BMSC sheets / FDB complex

七、统计学分析

结　果

一、antimiR-138 修饰的 BMSC 膜片的形态学观察

antimiR-138 修饰的 BMSC 膜片与未经转染修饰的 BMSC 膜片在形态上无明显差异。经过 10 天的连续培养，两组膜片均形成白色的膜样结构，并且可以完整地从培养板底部揭起，具有一定的厚度和韧性 （图2a，b）。对两组膜片的纵切面进行 HE 染色，结果显示两组膜片均由 6～7 层细胞组成，厚度约为 （50±5）μm （图2c，d）。同样的，膜片的扫描电镜结果显示两组膜片均含有丰富的细胞和细胞外基质。这表明 antimiR-138 的转染对膜片的形态结构无明显影响。

图2 antimiR-138 修饰的 BMSC 膜片与未经转染修饰的BMSC 膜片的形态学观察 a～b：实验组与空白对照组膜片形态的体视观察；c～d：实验组与空白对照组膜片形态倒置显微观察 （HE ×400）；e～f：实验组与空白对照组膜片形态的扫描电镜观察 （e 扫描电镜 ×1000；f 扫描电镜×800）Fig.2 Morphological observation of BMSC sheets transfected with antimiR-138 or not　a-b： Appearance of the BMSC sheets after detachment； c-d： Representative H&E staining images of

二、不同浓度 antimiR-138 修饰的 BMSC 膜片的荧光观察

在荧光体式及倒置显微镜下，随着 miRNA 浓度从 50 nM 增至 150 nM，膜片及膜片细胞中 Cy-3 标记的红色信号不断增强，这表明随着 miRNA 浓度的增加，膜片细胞对转染复合物的摄取在不断增加，而当浓度增至 150 nM 时，细胞对 miRNA 摄取达到饱和，即当转染复合物的浓度增至 200 nM 时，膜片细胞内的红色荧光不再增加 （图3）。

图3 不同浓度转染复合物对 BMSC 膜片转染后 24 h 的荧光体式及荧光显微观察 （Cy-3 / DIO 荧光染色 ×400），其中 Cy-3 标记的miRNA 显示红色荧光信号，DIO 标记的细胞膜显示绿色荧光信号，标尺代表100 μmFig.3 Representative fuorescence microscopy images showing the cellular miRNA uptake of BMSC sheets 24 h after transfection with different formulations. The Cy3-labeled miRNAs showed red and the cell bodies were stained with green color. The scale bar indicated 100 μm

三、不同浓度 antimiR-138 修饰的 BMSC 膜片的 miRNA-PCR 分析

固定转染试剂转染 antimiR-138 的方法可显著降低膜片细胞中内源性 miR-138 的含量，并具有浓度依赖性，其中 150 nM 组对内源性 miR-138 的抑制率最高，可达 85% （P＜0.001）（图4）。

图4 不同浓度转染复合物对 BMSC 膜片转染后 48 h 的 miRNAPCR 检测。a，bP ＜ 0.01，0.001 表示与空白对照组比差异有统计学意义；cP ＜ 0.01 表示与 50 nM 转染复合物组比差异有统计学意义；dP ＜ 0.05 表示与 100 nM 转染复合物组比差异有统计学意义Fig.4 The endogenous level of miR-138 assessed by Real Time RTPCR 48 h after transfection.a，bP＜0.01， 0.001 vs the no agent group；cP＜0.01 vs the 50 nM transfection formulation；dP＜0.05 vs the 100 nM transfection formulation

综合荧光体式观察、荧光显微观察以及 miRNAPCR 的结果，可以得出 Lipo 2000-miRNA 转染复合物可顺利被 BMSC 膜片所摄取，并且对 miR-138 的抑制具有剂量依赖性，其中 150 nM 组下调 miR-138的效率最高。因此，选择 150 nM 组进行下一步的研究。

四、细胞膜片 / FDB 复合体的组织学观察

对 4 周和 8 周取材的移植物分别进行 HE 和 MT染色。4 周时，仅在实验组移植物的内部观察到了新骨形成，并且在新骨表面可观察到骨衬里细胞，新骨的内部可观察到骨陷窝和骨细胞；而两个对照组内虽然有血管的长入，但仍是以纤维性愈合为主（图5）。移植后 8 周，实验组中可观察到广泛致密的新骨形成，新骨内可观察到典型的骨陷窝、骨细胞和骨衬里细胞并伴有血管生成，其骨形成主要以软骨内骨化为主。与此相反，对照两组，新生骨量较少且分布不均，同时仍有一些纤维结缔组织穿插在新生骨组织中 （图6）。

图5 膜片 / FDB 复合物裸鼠体内移植 4 周的显微染色观察 （其中 a，b，c HE ×100；d，e，f MT ×100，NB 代表新生骨，CT 代表纤维结缔组织，指示骨细胞，指示成骨细胞，代表新生血管）Fig.5 Representative H&E and MT staining images displaying the in vivo bone formation of the BMSC sheets / FDB complex after 4-weeks subcutaneous implantation. Neo-bone formation （NB）， connective tissue （CT）and FDB bone particles （FDB）were indicated. High-magnifcation images showed the osteocytes （）， osteoblasts （） and penetrating blood vessels （）

图6 膜片 / FDB 复合物裸鼠体内移植 8 周的显微染色观察 （其中 a，b，c HE ×100；d，e，f MT ×100，NB 代表新生骨，CT 代表纤维结缔组织，指示骨细胞，指示成骨细胞，代表新生血管）Fig.6 Representative H & E and MT staining images displaying the in vivo bone formation of the BMSC sheets / FDB complex after 8-weeks subcutaneous implantation. Neo-bone formation （NB）， connective tissue （CT）and FDB bone particles （FDB）were indicated. High-magnifcation images showed the osteocytes （）， osteoblasts （） and penetrating blood vessels （）

讨　论

考虑到细胞膜片在组织损伤修复与再生中的巨大的应用前景，采用基因技术对细胞膜片进行修饰，以提高其再生修复的效果，是非常有意义的。然而，迄今为止对于细胞膜片的基因修饰罕有报道，且局限于磁力辅助的病毒转染等方法［11-12］。非病毒转染法常规用于细胞转染［16］是较为安全可行的，本研究尝试将其应用于细胞膜片的转染，并对其可行性进行初步探索。本实验结果表明，通过对Lipofactamine 2000 转染试剂的用量及转染步骤加以优化，即可将以 antimiR-138 为代表的 miRNA 成功转入 BMSC 膜片中；并且 antimiR-138 的修饰显著提高了 BMSC 膜片 / FDB 复合体的异位成骨能力。

细胞膜片技术由于其独特的保存细胞外基质与细胞表面的蛋白的特性，在组织修复再生时明显优于传统单细胞悬液法与生物可降解支架等修复方式［17-19］。传统的细胞膜片培养需要专门设计的培养装置 （如：温敏培养皿）来收获细胞膜片［20-21］。近年来，国内外学者就如何简便、高效地获得细胞膜片进行了大胆的尝试，并提出了维生素 C （Ascorbic acid）连续诱导培养获细胞膜片的方法，即在培养液中加入维生素 C 或左旋 Vc 磷酸盐而无需特殊的设备［13-14］。研究还发现利用 Vc 培养的膜片较传统温敏法获得的膜片，具有更好的生物学性能 （良好的细胞干性维持、细胞外基质蛋白分泌增加、可操作性增强等）［13］。本研究尝试采用 Vc 连续诱导法构建 BMSC 膜片，并验证该方法的可行性。本研究发现，高密度接种的 BMSCs 通过在含 Vc 的膜片诱导培养基中连续培养 10 天，可形成一张约 50 μm 厚，含 6～7 层细胞的膜状结构，并且该结构富含细胞外基质与细胞-细胞间连接蛋白，且易于从培养板底部分离。同时研究还发现，对该膜片进行 miRNA 修饰后，BMSC 膜片仍能很好地维持其原有的形态结构。基于此，Vc 诱导法可在本实验中简单而有效地构建 miRNA 修饰的 BMSC 膜片。

基因治疗的载体系统对于稳定、高效地转染寡核苷酸是必不可少的。尽管病毒载体可高效的转染，并长期表达目的基因，但它却存在严重的安全风险，如细胞毒性，免疫原性和致瘤性等［22-23］，以及缺乏特异的细胞靶向性，难以储存和质量控制等一系列问题［24-25］。而非病毒载体似乎更容易克服上述问题［16，26］。本研究拟采用 Lipofectamine 2000 阳离子脂质体为载体构建转染复合物对细胞膜片转染。这也是迄今为止首次尝试采用非病毒方法对细胞膜片进行转染。为了使细胞膜片的转染获得理想的效果，需要对以 Lipofectamine 2000-miRNA转染复合物做以下优化，并对其介导的转染流程做一系列的调整。首先，笔者对转染复合物中Lipofectamine 2000 试剂的用量进行了优化。通常阳离子脂质包括 Lipofactamine 2000 在高剂量时是存在细胞毒性的［27］，因此要想在对细胞膜片进行转染的同时获得良好的生物相容性，控制转染复合物中Lipofactamine 2000 的用量是非常必要的。本研究观察到，当 Lipofectamine 2000 的用量在 5 μl / 孔时，在转染后 24 h 导致大量细胞死亡 （数据未显示）。（1）本研究采用 4 μl / 孔的 Lipofectamine 2000 用量对BMSC 膜片进行转染，图2 和图3 Dio 通道所示，转染后 48 h，膜片中的细胞生长良好，没有出现明显细胞毒性。（2）需要对转染复合物中 miRNA 的用量进行优化，以达到最高的转染效率。综合荧光染色和 miRNA-PCR 的结果，可以得出 150 nM 组的转染效率最高，其中转染基因对内源性 miR-138 水平的下调约为 85%。（3）在使用 Lipofectamine 2000 进行转染时，细胞膜的通透性会增加，这时如果有抗生素存在会影响基因转染效率并导致细胞毒性，因此需要在转染前 24 h 更换普通的膜片诱导液为无抗生素的膜片诱导培养基，从而尽可能地将抗生素从膜片培养液中除去。（4）延长转染时间至 24 h，而非单层细胞转染时推荐的 6 h，以实现膜片深层细胞的完全转染。（5）需要强调的是，在膜片转染的整个过程中，都需要使用膜片诱导培养基而非基础培养基。笔者之前失败的结果表明，如果在膜片转染过程中使用基础培养基，最后将无法形成结构完整的细胞膜片 （数据未显示）。而在转染过程中细胞膜片诱导培养基的使用可以自然地将转染过程与膜片形成过程整合在一起，从而成功构建出 miRNA 修饰的且具有良好形态结构的细胞膜片。总之，以上这些方案的调整可以使 Lipofectamine 2000 为载体的转染复合物适用于细胞膜片的转染。使用该方案可以构建出具有较高转染效率，良好的细胞相容性以及结构完整的 antimiR-138 修饰的 BMSC 膜片。

RNA 干扰是指外源或内源性 siRNA 或 miRNA进入细胞内能特异地结合相应的靶基因 mRNA，抑制其蛋白的翻译，从而抑制特定基因表达的现象。通常 siRNA 会导致特定靶基因的完全沉默，而miRNA 则可同时作用于多个基因并抑制其表达［28］。miRNA 可调控细胞功能的表达，包括细胞增殖、分化和凋亡等多种代谢过程［29］。不同的 miRNA 能够促进间充质干细胞 （MSCs）向不同方向进行分化，其中包括干细胞的骨向分化［28，30］。有研究发现，miR-138 是间充质干细胞成骨分化的负向调控因子，使用 antimiR-138 抑制内源性 miR-138 的水平后，可提高干细胞的体内成骨能力［30］。本课题组之前的研究也表明，将 antimiR-138 加载到细胞培养板或钛片表面对骨髓基质干细胞进行反向转染，可显著促进 BMSCs 的成骨分化［15］。本实验中膜片 / FDB复合物的异位成骨实验结果表明，antimiR-138 转染的 BMSC 膜片可显著促进并加速骨组织形成。尽管三组移植复合物均有促血管生成的能力，但三组的促成骨能力却表现出巨大差异：术后 4 周时，实验组移植复合物内已经开始有钙化软骨、骨细胞，成骨细胞生成，但此时两对照组中除一些纤维结缔组织外，未观察到骨组织的再生。术后 8 周时，实验组移植复合物内的新生骨不断改建并矿化成熟，形成大量致密且分布均匀的骨组织，且在其中可观察到典型的骨陷窝和骨细胞、成骨细胞并伴有血管的再生。与此相反，两对照组中仅表现出少量的新骨形成与血管再生，同时一些纤维结缔组织仍然残留在新生骨组织中。综上所述，antimiR-138-BMSC 膜片 / FDB 复合物在体内表现出优秀的促新骨形成能力，这一技术将为骨缺损的修复和再生提供新的思路和方法。

本实验通过对以 Lipofectamine 2000 为载体的转染复合物进行优化，构建出具有较高转染效率，良好的细胞相容性以及结构完整的 antimiR-138 修饰的BMSC 膜片。进一步研究发现，antimiR-138 可有效促进 BMSC 膜片 / FDB 复合物的异位骨形成。该技术为骨缺损的修复和再生提供新的思路和方法。

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（本文编辑：李贵存）

Fabrication of antimiR-138 delivered mesenchymal stem cell sheet and its effects on freeze dried allograft bone

osteogenesis

YAN Jun， ZHAO Yan-tao， ZHANG Jing， WU Chen， CHEN Jing-yuan， ZHANG Yu-mei. The second Artillery Engineering University， Xi'an， Shaanxi， 710025， PRC

ZHANG Yu-mei， Email： wqtzym@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo verify the feasibility of transfecting the bone mesenchymal stem cells （BMSC）sheets with the non-viral way and to confirm the osteogenesis enhancing effects of antimiR-138 delivered BMSC sheet / freeze dried bone （FDB）complex. MethodsA continuous vitamin C inducing method was used to culture the BMSC sheets， which were later transfected with different Lipofectamine 2000-miRNA lipoplexes. The transfection efficiencies of different formulations were assessed by the miRNA RT-PCR. H&E staining and SEM observation were performed to evaluate the harvested sheets. The ectopic bone regeneration ability of the BMSC sheet / FDB complexes were assessed in immunocompromised mice： H&E or Masson's Trichrome staining were used to assess the osteogenesis of the BMSC sheet / FDB complexes in SCID mice 4 and 8 weeks after implantation. ResultsThe BMSC sheets were fabricated by a vitamin C inducing method. They could be successfully transfected with antimiR-138 to achieve a transfection effciency of nearly 85% by a Lipofactamine2000 based transfection formulation after proper adaption and optimization. The in vivo ectopic bone regeneration results confrmed the robust enhancing effects of antimiR-138 transfection on the bone regeneration ability of BMSC sheets combined with freeze dried allograft bone. Conclusions（1）Satisfactory transfection effciency of nearly 85%， good cytocompatibility and unimpaired cell sheet structure can be obtained by properly optimizing the Lipofactamine 2000 based transfection formulation. （2）The antimiR-138 transfection signifcantly enhances the osteogenesis of the BMSC sheet/FDB complexes in vivo， showing great clinical signifcance for bone repair and regeneration.

Mesenchymal stem cells；Transfection；MicroRNAs；Transplantation， homologous；Osteogenesis；Cell sheets

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.11.007

R318

国家自然科学基金项目 （81501611），（81470785）

710025西安，第二炮兵工程大学校务部 （闫钧、陈静园、吴琛、张京）；710032西安，第四军医大学口腔医学院修复科 （张玉梅）；100048北京，北京市骨科植入医疗器械工程技术研究中心 （赵彦涛）

张玉梅，Email： wqtzym@fmmu.edu.cn

2015-08-04）