巯基化透明质酸对退变性骨关节炎的潜在治疗研究

魏长征　吴宋瑞瑞　蒋丽霞

巯基化透明质酸对退变性骨关节炎的潜在治疗研究

目的 制备一种具有一定清除自由基能力的巯基化透明质酸，为其临床上治疗骨关节炎提供基础理论依据。方法 以透明质酸钠为原料，用 1- （3- 二甲氨基丙基）-3- 乙基碳二亚胺 （EDC）活化羧基，加入带二硫键的化合物——胱胺二盐酸盐，使其与透明质酸钠的羧基反应交联成带稳定二硫键的透明质酸水凝胶，再用二硫苏糖醇 （DTT）还原二硫键成巯基，制得巯基化透明质酸。结果 该制备得巯基化透明质酸的巯基含量平均达到 24.19%。对其进行还原力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力检测表明，该巯基化透明质酸还原力相当于同等浓度维生素 C 的 （4.15±0.21）%，对羟自由基的 50% 清除浓度约为5 mg / ml，对邻苯三酚的自氧化反应也有显著的抑制作用，加入 10 mg / ml 的该样品其邻苯三酚的氧化速率仅为原始自氧化速率的 20% （P＜0.05）。结论 注射透明质酸对关节软骨有很好的润滑作用，同时用巯基改性后具备较好的抗氧化性能。巯基化合物作为供氢体，去猝灭自由基，自身被氧化成稳定的二硫键，不会再发生链反应。本实验利用巯基的抗氧化性，改性透明质酸钠，使其具备一定的抗氧化性能，即清除自由基能力，为其临床的进一步应用提供了基础理论依据。

透明质酸；自由基；骨关节炎

随年龄增长，骨关节炎 （osteoarthritis，OA）的发生率明显增高。骨关节炎是在力学和生物学因素共同作用下，导致软骨细胞、细胞外基质以及软骨下骨三者降解和合成正常偶联失衡的结果［1］，其病理特征为关节软骨出现原发性或继发性退行性病变，并伴有软骨下骨质增生。多年研究发现骨关节炎与外伤、炎症、衰老、代谢和免疫等因素有关。

近年来，随着逐渐深入研究炎症反应在骨关节炎发病机制中的作用，人们发现自由基 （free radical）可对关节软骨造成一定程度的损伤，可能参与到骨关节炎的病理过程中［2-5］。关节软骨由维持功能的基质及软骨细胞组成，软骨基质的组成物质有胶原、蛋白多糖和水。自由基作用于胶原的氨基酸、脂链等，改变了胶原蛋白的一级结构，其二级和三级结构均遭破坏，并发生变性、疏水性增加、分子聚合（非共价聚合）；或分子间共价键形成 （共价聚合）——多聚体；或发生断裂，使胶原纤维失去正常的拱形结构及生理功能，造成关节软骨的损伤。另外，自由基还可通过对细胞生物膜、蛋白质、核酸等的损伤，可引起软骨细胞的形态、生长状态和功能改变，抑制软骨细胞蛋白多糖的合成功能，使胶原的分泌由 II 型转变为 I 型，势必引起软骨的损伤退变［6］。

自由基代谢中与骨关节炎关系最密切的是活性氧 （ROS）的代谢［7］。ROS 是由氧形成的几种活性物质的总称，主要有超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢、单线态氧 4 种，前两者称为氧自由基。已证明在骨关节炎关节液中氧自由基含量升高。自由基反应的最大特点是化学活性强，寿命短，反应常呈连锁性。只要加入少量引起剂，整个反应就可启动，只要加人少量清除剂，整个反应就可受到抑制［8］。自由基清除剂是指能清除自由基或能阻断自由基参与的氧化反应的物质。目前应用的自由基清除剂主要有二大类，一是抗氧化酶，如超氧化物歧化酶 （SOD）、过氧化氢酶 （CAT）、谷胱甘肽-过氧化物酶 （GPX）等；二是清除自由基的抗氧化剂类，如维生素 E （Vit E）、维生素 A （Vit A）、维生素 C（Vit C）、β- 胡萝卜素、还原型谷胱甘肽 （GSH）等活性肽类［7］。

巯基是在生物体内天然存在的具有良好生物相容性的官能团，它具有很好的反应活性，在相同的条件下其反应活性通常比氨基高好几个数量级。巯基是一种还原性很高的化学键，可通过简单氧化得到稳定的二硫键。这就是巯基化合物作为抗氧化剂通过抑制或减缓自由基的生成来达到抗氧化的目的［9］。现在较常见的巯基化合物有半胱氨酸、谷胱甘肽 （还原型）等［9］。但是这类化合物均为小分子化合物，在体内易代谢，残存时间短。如何延长体内残存时间，更好地发挥巯基的抗氧化能力，是这类化合物用于抗氧化应用的关键［10］。

透明质酸是一种细胞外基质中普遍存在的物质，广泛分布于人和动物各组织中，如玻璃体、关节滑液、滑膜、软骨等，是关节软骨基质的重要组成成分。它是由 （1-β-4）D- 葡萄糖醛酸（glucosamine）和 （1-β-3）N- 乙酰基 -D- 葡萄糖（glucuronic）交替联结而成的线型多糖，是高相对分子质量物质。多项研究显示，透明质酸以其物理化学性质及细胞生物学性质为基础，通过覆盖、润滑及缓冲关节软骨应力，减轻炎症关节内反应，促进内源性大分子透明质酸合成分泌［11-16］。本研究利用巯基的抗氧化性及清除自由基能力，改性透明质酸钠，使其具备一定的抗氧化性能，即清除自由基能力，为其临床的进一步应用提供基础理论依据。

材料与方法

一、材料

胱胺二盐酸盐、1- （3- 二甲氨基丙基）-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐 （EDC·HCl）、二硫代苏糖醇 （DTT）（上海金穗生物科技有限公司）；N- 羟基琥珀酰亚胺、1，10- 菲啉·一水、邻苯三酚 （国药集团化学试剂有限公司）；2，5- 双 （5- 叔丁基 -1，3- 苯并唑-2- 基）噻酚 （BBOT）（Thermo Scientific 公司）；三氯化铁·六水 （Aladdin）；铁氰化钾、过氧化氢、氢氧化钠 （上海凌峰化学试剂有限公司）；三羟甲基氨基甲烷 （Alfa Aesar）；氯化钠 （江苏省勤奋药业有限公司）；盐酸 （宜兴市第二化学试剂厂）；透明质酸钠（山东华熙福瑞达生物医药有限公司）。

紫外-可见光分光光度仪 （UNICO 公司，美国）；元素分析仪 （Thermo Scientific 公司，美国）电子天平 （Mettler-Toledo 公司，瑞士）；恒温水浴锅、UXH 漩涡混合器 （上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

二、实验方法

1. 巯基化透明质酸的合成：称取胱胺二盐酸盐0.56 g，EDC·HCl 0.48 g，NHS 0.29 g，依次加入到20 ml 去离子水中，搅拌至溶解，再用 1 M HCl 调节pH 值至 5.5。称取透明质酸钠 （100 万，Mw）1 g，加入至上述混合液中，搅拌使其完全溶解至均一状态。于 4 ℃ 下反应 72 h，将所得凝胶切至约 0.2 g 重小块，于磷酸缓冲液 （0.2 M，pH 7.2）中透析至凝胶重量恒定为止。

称取 DTT 0.38 g，溶于 10 ml 去离子水中，再加入 10 g 透析后凝胶，用 1 M NaOH 调节 pH 值至8.0，搅拌 1 h 至完全溶解。反应结束后，即将反应混合物置于透析袋 （截留分子量 14 000 Da），用 2 L0.3 mM HCl 和 0.1 M NaCl 溶液透析 3 天，每 8 h 换1 次透析液；再用 2 L 0.3 mM HCl 溶液透析 2 天，每8 h 换 1 次透析液。最后收集透析袋中的溶液，冷冻干燥得白色絮状固体。

2. 巯基含量的测定：将上述所合成的巯基化透明质酸白色絮状固体用玛瑙研钵研磨至细末，随后放入 105 ℃ 烘箱恒重至干燥，取出放入干燥皿中冷却 20 min。各精密称取 3 份 2，5- 双 （5- 叔丁基-1，3- 苯并唑 -2- 基）噻酚 （BBOT 标准品）和样品（2.5±0.5）mg，放入锡囊中，挤压包裹，放入元素分析仪进样检测。

巯基含量的计算公式如下：

CS：巯基化透明质酸的 S 元素的百分含量；

CN：巯基化透明质酸的 N 元素的百分含量。

3. 红外光谱扫描：利用红外光谱法对制备的巯基化透明质酸样品进行结构表征。采用 KBr 压片法，测定样品的红外吸收光谱。

4. 还原能力：还原力的测定主要步骤如下：配置 5 mg / ml 的上述合成的巯基化透明质酸，梯度稀释至 5、1、0.5、0.1、0 mg / ml，作为样品 A；另配置 0.1 mg / ml 维生素 C 溶液作为样品 B，浓度为0.1、0.08、0.04、0.02、0.01 mg / ml。各取 1 ml 各浓度样品 A、B 于 10 ml 试管中，依次加入 2.5 ml 铁氰化钾溶液 ［ K3Fe（CN）6，1% ］，2.5 ml 磷酸钠缓冲液（0.2 M，pH 6.6），混匀后在 50 ℃ 保温 20 min。然后再依次加入 2.5 ml 三氯乙酸 （10%）和 0.5 ml 三氯化铁 （FeCl3，0.1%）。在 700 nm 处测定混合液的光吸收值。

5. 清除羟自由基能力：羟自由基清除能力的测定如下。首先配置 5 mg / ml 的上述合成的巯基化透明质酸，梯度稀释至 5、2.5、1、0.1、0 mg / ml。取 1 ml 不同浓度样品，依次加入 1 ml 1，10- 菲啉（1 mM）、1 ml 磷酸缓冲液 （20 mM，pH 7.4）、1 ml硫酸亚铁铵 ［ FeSO4·（NH4）2SO4·6H2O，0.75 mM ］ 和1 ml 过氧化氢 （0.01%）。反应液混匀后，在 37 ℃ 下保温 1 h。结束后，代反应液冷却至室温，测定在536 nm 处的光吸光值。

反应混合液的光吸收值降低说明待测化合物有羟自由基清除能力，清除百分率的计算如下：

A536 （样品）：加 H2O2和待测样品；A536 （损伤）：加 H2O2和待测样品；A536 （未损伤）：加待测样品不加 H2O2。

6. 清除超氧阴离子能力：超氧阴离子自由基（·O2-）的清除能力的测定采用钦传光等的方法并稍作改进。首先取 0.98 ml 浓度为 10 mg / ml 的巯基化透明质酸样品，加入 5 ml Tris-HCl 缓冲液（0.05 M，pH 8.2），在 25 ℃ 中保温 10 min，再加入20 μl 邻苯三酚 （50 mM，用 0.01 M HCl 配置）。立刻测定混合液在 325 nm 处的光吸收，每 10 秒读一次数，根据 A325 nm - 时间的关系计算出邻苯三酚的氧化速率。对照组中不加待测化合物。待测化合物对邻苯三酚氧化速率的抑制可以反映出其清除超氧阴离子自由基的能力。

三、统计学方法

实验均重复 3 次。采用 Origin 9 统计软件进行分析，同时对数据进行线性拟合并考察线性相关系数。数据以±s 表示，组间比较采用使用 Minitab软件进行方差分析，检验水准 α=0.05。

结　果

一、巯基化透明质酸的合成

巯基化透明质酸的合成路径图（图1），即胱胺上的氨基与透明质酸上的羧基在 EDC 的作用下发生酰胺化反应，从而交联得由稳定二硫键连接的透明质酸水凝胶。而后，利用二硫苏糖醇的强还原性质，使得二硫键断开形成巯基。

经由元素分析仪检测得该样品的 N、C、H、S 含量分别为 （5.16±1.01）%、（37.64±1.87）%、（5.40±0.25）%、（3.84±0.73）%。通过元素分析法计算而得，制备样品的平均巯基含量为 24.19%。

图1 巯基化透明质酸的合成路径图Fig.1 The synthetic path of the thiol-modifed hyaluronic acid

二、红外谱图

从检测巯基化透明质酸样品的红外谱图（图2）中可得，与未改性的 HA 相比，3398.8 cm-1与2926.9 cm-1处的吸收峰都有了较大的增强，这是因为酰胺化以及 S-H 的影响。另外，图中 2562.5 cm-1附近处增加了一个-SH 的伸缩振动峰，说明新物质带有-SH 基团。可认为成功合成巯基化透明质酸。

图2 巯基化透明质酸的红外谱图Fig.2 The FTIR spectra of thiol-HA

三、还原能力

具有还原力的样品使铁氰化钾的 Fe3+还原成Fe2+（亚铁氰化钾），Fe2+（亚铁氰化钾）进一步在和三氯化铁的反应下生成在 700 nm 处有最大吸光度的普鲁士蓝 ｛ Fe4［Fe（CN）6］3｝。

图3 表示不同浓度的巯基化透明质酸与维生素 C 经处理后在 700 nm 处产生的吸光值对比。从图中可以看出，经巯基改性后的 HA 呈现一定的还原力，虽然与维生素 C 相比还原力很弱，但是作为高分子物质，其在生物医用上有优于 Vc 的优势。

图3 各浓度巯基化透明质酸与维生素 C 的还原力对比Fig.3 The reducing forces of different concentrations of thiol-HA and vitamin C

四、清除羟自由基能力

邻二氮菲可与 Fe2+形成络合物，此络合物在536 nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过 Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲-Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲-Fe3+后，其 536 nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则 Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲-Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以 A536 变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。

Fe2++H2O2→ Fe3++· OH+OH

Fe2++邻二氮菲 → Fe2+- 邻二氮菲 （Amax=536 nm）

· OH+Fe2+- 邻二氮菲 → Fe3+- 邻二氮菲

如图4 所示，各浓度待测化合物均表现出清除Fenton 反应产生的羟自由基的能力，而且其清除作用与浓度成依赖关系。另外，5 mg / ml 的巯基化 HA能基本达到清除 50% 的羟自由基。

图4 各浓度巯基化透明质酸的羟自由基清除百分率Fig.4 The rate of hydroxyl radical scavenging of different concentrations of thiol-HA

五、清除超氧阴离子能力

在弱碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化反应，生成·O2- 和有色中间产物，该中间产物在 λ= 325 nm 处有一特征吸收峰。在初始阶段，中间产物的量与时间呈线性关系。当加入·O2- 清除剂时，它能迅速与·O2- 反应，从而阻止中间产物的积累，致使溶液在 λ=325 nm 处吸收减弱。故可以通过测定 A325 值来评价清除剂对·O2- 的清除作用。

如图5 所示，未加巯基化 HA 的对照组中，邻苯三酚在弱碱性环境下发生自氧化，于 λ=325 nm处产生特征峰，至 10 min 时该吸光值线性增加，并在 30 min 内完全被氧化，超氧阴离子被全部释放。而加入了待测样品 （浓度为 10 mg / ml 的巯基化 HA）后，自氧化生成的超氧阴离子被大量清除，λ=325 nm 处的特征峰也大大削弱，6 min 后才产生可检测到的吸光值，图5 显示所测样品对邻苯三酚的自氧化反应有显著的抑制作用。此外，根据初始阶段 A325 nm - 时间的关系计算出邻苯三酚的氧化速率可知，加入待测化合物后，邻苯三酚自氧化反应的速率均降低。加入浓度为 1、5、10 mg / ml 的检测样品后，其氧化速率分别降低至（79.61±4.93）×10-3/ min、（55.18±3.44）×10-3/ min和 （18.22±1.13）×10-3/ min。相比于邻苯三酚自氧化速率 （89.07±5.56）×10-3/ min，差异均有统计学意义 （P＜0.05）。

图5 10 mg / ml 浓度的巯基化透明质酸的超氧阴离子清除能力Fig.5 The rate of superoxide anion clearance of 10 mg / ml of thiol-HA

讨　论

骨关节炎的变化可分成两个病理过程［17］：（1）关节的原发性增生性改变，主要在软骨周围及滑膜；（2）关节软骨的退行性变。骨关节炎的特征可概括为：（1）功能退变；（2）软骨损害；（3）关节表面周围的新骨形成。机械和生物学因素的相互影响，是它受累的原因。临床上骨关节炎可以分为原发性和继发性，后者引起软骨退行性变的直接原因为结构改变、炎症、代谢等；原发性骨关节炎的原因有各种各样的遗传因素、环境因素等，特别是老化过程、正常的磨损、慢性损伤、肥胖、饮食等都可能是发病因素，从现代生物学研究表明，细胞因子、生长因子、免疫因素等都与骨关节炎的发病有关。

目前，治疗关节炎的方法主要有口服止痛药、人工注射透明质酸液或止痛药、手术治疗以及补充氨糖疗法。其中人工注射透明质酸液可以润滑关节，暂时控制症状，而且透明质酸的半衰期只有2～3 天，该方法需不断补充新的透明质酸，但无法逆转病变。另外最有效的补充氨糖疗法是根据骨关节炎形成的根本原因，通过外源性的补充氨糖，补充关节软骨合成必要营养，帮助重新长出正常的关节软骨。目前已经有 100 多个国家，把氨基葡萄糖疗法视为治疗膝关节炎的最佳方法。

本实验结合了人工注射透明质酸钠溶液法和氨糖疗补充法两者的优点，制备了一种有治疗关节软骨作用的功能化透明质酸，既能润滑关节，又能帮助正常关节软骨形成。透明质酸是关节滑液及软骨的重要组成部分，研究表明青年人、老年人和骨关节炎患者关节腔内透明质酸的浓度和分子量呈依次递减规律，同时在人进行奔跑即剪切频率增大时，青年人关节腔内滑液呈剪切变稀现象，而骨关节炎患者则不会，故其无法起到正常的润滑作用［18］。另有文献证明，氨基酸接枝后的透明质酸的动力黏度下降明显，这对覆盖、润滑及缓冲关节软骨应力，减轻炎症关节内反应有理论上的辅助作用［19］。本研究利用胱胺的氨基与透明质酸的羧基进行酰胺化反应，再通过还原二硫键使其形成带还原性能的巯基，从病源上清除患者关节腔内高浓度的氧自由基，保护关节软骨，减缓其损伤退变，从而达到治疗骨关节炎的目的。

骨关节炎患者的关节腔内高水平的氧自由基主要来源于免疫和炎症过程中，中性粒细胞、巨噬细胞、炎性滑膜等均可产生过量氧自由基。骨关节炎患者的红细胞内 SOD （超氧化物歧化酶）明显下降，血浆 LPO （脂质过氧化物）含量明显增高，二者含量呈负相关。而软骨细胞重复暴露于过氧化物或超生理范围的氧压力下，造成慢性氧化应激，可使软骨细胞过早老化。主要原因是过多产生的氧化剂对软骨细胞造成了破坏。可见随着年龄增长软骨细胞老化进一步加速，并提示氧化损伤在这一过程中扮演了一个重要角色。

本研究提供了一种具有抗氧化作用的透明质酸钠衍生物，其凝胶的主体仍然为透明质酸钠，它是人体关节润滑液的主要成分，具有减震、润滑以及营养关节软骨的作用；巯基化透明质酸钠在保持天然透明质酸钠凝胶生物学活性的基础上，还具有清除自由基和抗氧化的活性，利用其巯基的还原性能，进入患者关节腔内有一定的清除自由基作用，同时在该氧化环境中能发生自身的弱交联反应，形成较稳定的二硫键。与非共价键相反，二硫键不会受到离子强度和 pH 强度的影响。这使得弱交联后的透明质酸较其本身抗酶降能力更强，体内存留时间更长，也对润滑关节软骨作用有利。此时二硫键形成的速度和程度取决于硫负离子的浓度。硫负离子的浓度又取决于巯基的 pKa 值、硫醇物和反应介质的 pH 值。这对巯基 / 二硫键的交换反应和氧化过程都是有影响的。

巯基化透明质酸钠凝胶具有较好的清除自由基和抗氧化生物活性，同时保留了天然透明质酸钠凝胶独特的生物学特性，即良好的黏弹性和生物相容性，能够起到良好的润滑、减震以及营养软骨细胞的作用，对于退变性骨关节炎的预防和治疗具有良好的应用前景。

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（本文编辑：李贵存）

Research on the potential treatment of degenerative osteoarthritis by thiol-modified hyaluronic acid WEI

Chang-zheng， WU Yi， SONG Rui-rui， JIANG Li-xia. Shanghai Qisheng Biological Preparation Co.， Ltd. Shanghai，201106， PRC

ObjectiveTo synthesize a thiol modifed hyaluronic acid with a certain ability of scavenging free radicals and to provide theory basis for the clinical treatment of osteoarthritis. MethodsSodium hyaluronic acid （HA）as raw material， 1- （3-dimethylaminopropyl）-3- ethylcarbodiimide hydrochloride （EDC）was used to activate the carboxyl of HA and cystamin dihydrochloride was introduced to crosslink the HA hydrogel. Subsequently，dithiothreitol （DTT）was used to deoxidize the disulfde linkage into thiol and the thiol-HA was achieved. Results The thiol content of thiol-HA was 24.19%. The reducing capacity， the rate of hydroxyl radical scavenging and the rate of superoxide anion clearance were chosen to evaluate the antioxidant activities of the thiol-HA. The experimental results showed that the reducing force of the thiol-modifed HA was equivalent with （4.15±0.21）% of vitamin C at the same concentration. Meanwhile， the concentration of the thiol-HA at 50% of the hydroxyl free radical scavenging was about 5 mg / ml. 10 mg / ml of the sample was added， the oxidation rate of pyrogallol was decreased to 20% of its autoxidation rate （P＜0.05）. ConclusionsThe articular cartilage is well lubricated by the injection of hyaluronic acid. Better oxidation resistance is achieved by the modifcation of thiol. As a hydrogen donor， free radicals are quenched by thiol compounds which are oxidized to stable disulfide bond without chain reaction. In this research， sodium hyaluronate is modifed by thiol with its oxidation resistance， therefore a certain antioxidant property is achieved with the ability of scavenging free radicals. And a theory basis is provided for the further clinical application.

Hyaluronic acid；Free radicals；Osteoarthritis

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.11.006

R684.3， R915

上海市产学研合作项目 （11DZ1921400）

201106 上海其胜生物制剂有限公司

2015-06-11）