利那洛肽的合成

周 黎，乔春华

（苏州大学 医学部药学院，江苏苏州 215123）

利那洛肽（Linaclotide，1）是由美国Ironwood 公司研发的一种鸟苷酸环化酶C（GC-C）激动剂[1]，于2012年8月30日获美国FDA 批准上市，用于治疗便秘肠易激综合（IBS-C）和慢性特发性便秘（CIC），它是首个具有此种作用机制的治疗便秘的药物，被FDA 唯一批准的可用于临床的肠道局部起效的GC-C 激动剂类药物，也是欧洲首个获批用于治疗中重度IBS-C 成人患者的新型处方药物[2]。1为含有三对二硫键的十四肽，其氨基酸序列为：H-Cys1-Cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cys10-Thr11-Gly12-Cys13-Tyr14-OH（二硫键连接方式为Cys1-Cys6，Cys2-Cys10，Cys5-Cys13），氨基酸序列如下：

作为一种含有多对二硫键的多肽，分子结构中二硫键的准确配对是合成1的关键技术[3]。通过氧化形成三对二硫键的时候，情况较为复杂，反应往往会错配形成多种异构体。因此，通过选择性氧化二硫键合成1可以很好地避免错配异构体的产生。

本文采用三苯甲基（Trt），乙酰氨甲基（Acm）和叔丁基（tBu）这三种常见的可以正交保护半胱氨酸的保护基，分别通过过氧化氢，碘和PhS（O）Ph/Ch3SiCl3体系分步氧化形成三对二硫键[4-5]，其肽序中的三对二硫键Cys1-Cys6，Cys2-Cys10，Cys5-Cys13，分别使用叔丁基（tBu）、三苯甲基（Trt）和乙酰氨甲基（Acm）作保护策略。合成示意如下：

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

DIONEX LCMS 质谱仪；DIONEX UltiMate 3000 型高效液相色谱仪；汉邦5cm 制备型高效液相色谱；司乐85-1磁力搅拌器；东旺TD5K 低速台式离心机；金石6210型真空干燥箱；BUCH 旋蒸；四环冷冻干燥机；普瑞逊HT1000N 电子天平；多肽合成反应柱（定制）；

利那洛肽对照品（Linaclotide，Toronto Research Chemicals. Canada）；2-氯三苯甲基氯树脂（2-CTC Resin，1.0mmol/g，西安蓝晓科技新材料股份有限公司）；保护氨基酸（纯度＞98%，成都泰和伟业生物科技有限公司）；缩合试剂（纯度＞98%，苏州昊帆股份有限公司）；色谱级乙腈（ACN，天津市康科德科技有限公司）；其余实验所用化学试剂均为市售分析纯。

1.2 1的固相合成[6-7]

1.2.1 中间体Ⅰ 的制备

称取2-CTC Resin 树脂（10g，1.0mmol/g）投入多肽合成反应柱中，加入DCM（150mL）溶胀30min，抽滤，除去滤液；另称取Fmoc-Tyr（tBu）-OH（3.5g，7.5mmol）于烧杯中，加入DMF（100mL）搅拌溶解，加入DIEA（3.4mL，18mmol）进行冰浴活化，5～10min 后倒入反应柱中，20～30℃反应2h，除去液体，用DMF（3*100mL）洗涤，加入封闭液（DCM ∶MeOH ∶DIEA=80 ∶15 ∶5，体积比）100mL，封闭两次10min，封闭结束后用DMF（4*100mL）洗涤，再用甲醇（3*100mL）收缩，每次10min，抽干树脂，真空干燥14h得中间体Ⅰ 13.1g，替代度测定结果为0.58mmol/g。

肽链的延伸：将中间体Ⅰ 8.6g（5mmol）投入到反应柱中，根据Fmoc 固相多肽合成的原理，脱Fmoc 基团采用20% Pip/DMF 脱2次（5+15min），氨基酸偶联以DIC/HOBT 为缩合体系，DMF 为反应溶剂，按3eq 投料，依次缩合Fmoc-Cys-OH、Fmc-Gly-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn（Trt）-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Cys-OH，缩合过程中采用Kaiser 法判断反应终点，最终得线性肽树脂 22.8g。

1.2.2 中间体Ⅱ的制备

将线性肽树脂22.8g（5mmol）加入切割液（TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚=90/5/3/2，体积比，200mL）中，室温切割2.5h。抽滤，滤饼用少量TFA 洗涤，合并滤液和洗液，向滤液中缓缓加入2L 冰MTBE 进行沉降，离心，弃上清液，用MTBE（3*400mL）洗涤，真空干燥14h 得中间体Ⅱ 10.72g。

1.3 1的二硫键配对[8-10]

1.3.1 中间体Ⅲ的制备

将得到的中间体Ⅱ 10.72g（5mmol）加入烧杯中，加入2 500mL 15%的ACN/纯化水溶液，用氨水调制pH=8.0～9.0，加入过氧化氢1.5mL，室温搅拌1h，用冰乙酸调pH=4.0左右，经制备型HPLC 纯化，收集大于95%的样品，浓缩冻干制得中间体Ⅲ 7.67g。

1.3.2 中间体Ⅳ的制备

将上步得到的中间体Ⅲ 7.67g（约4.3mmol），加入2 150mL 10%的冰醋酸/纯化水溶液中，室温搅拌，逐步滴入浓度为5mmol/L 的碘乙醇溶液至溶液呈橙红色，保持反应1h，然后滴入浓度为0.1mmol/L 的抗坏血酸水溶液至溶液褪色，经制备型HPLC 纯化收集大于95%的样品，浓缩冻干制得中间体Ⅳ 4.58g。

1.3.3 1的制备

将上步得到的中间体Ⅳ 4.58g（约2.8mmol），加入1 400mL 三氟乙酸溶液中，依次加入二苯亚砜5.66g，三氯甲基硅烷41.85g，室温搅拌1h，将溶液逐渐滴入7 000mL MTBE中，静置，离心，弃上清，收集沉淀物，用适当MTBE 重复洗涤2～3次，干燥得1粗品3.24g，最后经制备型HPLC 纯化收集大于95%的样品，浓缩冻干制得12.11g，纯度为98.02%。HPLC 图谱（见图1）与对照品（见图2）一致，MS（ESI）：761.9[M-2H]2-。

图1 利那洛肽样品的HPLC色谱图

2 结语

本文运用选择性氧化策略，采用Trt、Acm 和tBu 保护的半胱氨酸进行利那洛肽的合成，分步氧化形成二硫键，有效地降低了二硫键的错配率。并通过对比不同树脂载体以及二硫键氧化的顺序，得到一条较高收率的合成方法，为利那洛肽的合成提供借鉴。

图2 利那洛肽标准品的HPLC色谱图