南极磷虾自溶过程蛋白质组分含量变化

黄显彬，曹 荣，李智博

（1.大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁 大连 116000；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071）

南极磷虾（Euphausia superba）属于无脊椎动物中的节肢动物门、甲壳纲、软甲亚纲、磷虾目，广泛分布于南极水域，生物量达数亿t[1]。随着近海渔业资源的日益减少，南极磷虾资源受到世界渔业发达国家的广泛关注，我国也极为重视南极磷虾的开发，并于2009年开始对南极磷虾进行商业捕捞和加工利用[2]。

南极磷虾富含优质蛋白，但体内含有活性很高的蛋白酶系[3]，南极磷虾起捕后会迅速发生自溶。因此，南极磷虾捕捞后需立即冷冻或加工，但是遇到捕捞量集中的情况，南极磷虾往往得不到及时处理，会导致原料品质劣化[4]，造成经济损失。南极磷虾蛋白质极易自溶的生物学特性严重束缚了资源的高效利用，对南极磷虾自溶机理与自溶过程的研究一直是国内外科研人员的研究热点。如迟海等[5]分析了南极磷虾0、5 和20℃条件下细菌总数、嗜冷菌数、TVB-N和TMA-N 等鲜度指标的变化情况；李学英[6]等对南极磷虾0～3℃冷藏过程中pH、出肉率、可溶性蛋白等生化指标进行了研究。而目前有关南极磷虾自溶过程蛋白质组分含量变化的系统研究还较少。

本文研究了南极磷虾在4℃和20℃条件下非蛋白氮（NPN）、TCA 可溶性蛋白、氨基酸态氮以及TVB-N 等含量的变化情况，旨在进一步探索南极磷虾自溶规律，为南极磷虾蛋白的高效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

南极磷虾，由“南极磷虾资源分布与冷链技术”项目组于2014年5月在南极48.1 渔业区捕捞，捕捞后迅速保存在-20℃冰柜中，2014年7月运抵实验室后，继续保存于-60℃超低温冰箱中备用。

1.2 仪器设备

DNP-9162 型恒温培养箱（上海精密试验设备公司）；HH-4 型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；TYS-200 型多功能高速粉碎机（浙江省永康市红太阳机电有限公司）；UV-2802 型紫外/可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）；冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；DZ-400/2L 型真空包装机（诸城市广元包装机械厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品解冻 冻结的南极磷虾样品采用流水方式解冻。具体操作步骤为：冻结的南极磷虾放入真空包装袋中，抽真空，之后置于塑料盒中，采用自然流水解冻。以南极磷虾个体基本分离作为解冻终点。将解冻的南极磷虾样品分别置于4℃和20℃培养箱中贮藏，在0、1、2、4、6、8 h 时取样进行各项指标的测定。

1.3.2 粗蛋白质含量测定 参照GB/T 5009.5-2010[7]，采用凯氏定氮法。

1.3.3 非蛋白氮（NPN）与TCA 可溶性蛋白含量测定 将南极磷虾按照1 ∶4（m/v）比例均质。准确称取匀浆液10 g，精确到0.001 g，置于100 m L 离心管中，加入10 m L 10%三氯乙酸（TCA）溶液，振荡器震荡1 min，静置30 min，之后8 500 r/min 离心20 min，取上清液备用。取上清液10 m L，采用凯氏定氮法测定其中的氮元素含量，即为非蛋白氮。取上清液1 m L于试管中，采用双缩脲法测定TCA 可溶性蛋白含量。

1.3.4 氨基酸态氮含量测定 参照GB/T 5009.39-2003[8]，采用比色法测定。

1.3.5 总挥发性盐基氮（TVB-N）含量测定 参照SC/T 3032-2007[9]，采用微量扩散法。

1.3.6 数据处理 采用SPSS 17.0 软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾自溶过程中NPN 含量变化

由图1 可以看出，南极磷虾初始NPN 值较高，达到5.25 mg/g，占南极磷虾总氮的20.70%，这与磷虾原料历经长时间的冷链运输有关。在4℃和20℃条件下，南极磷虾NPN 含量都随着时间的延长而增加。在最初的1 h 内，4℃和20℃两组的NPN 无显著差异，从2 h 开始，20℃组的NPN 含量开始显著高于4℃组（P<0.05），这说明南极磷虾的自溶酶系在20℃时具有很高的活性，导致蛋白大量降解，至8 h 时已达到12.67 mg/g，占到总氮的49.96%。4℃条件下，NPN含量的增加较为缓慢，8 h 时为8.40 mg/g，占总氮的33.12%，说明低温在一定程度上抑制自溶酶系的活力。

2.2 南极磷虾自溶过程中TCA 可溶性蛋白和氨基酸态氮含量变化

由图2 可以看出，20℃条件下TCA 可溶性蛋白含量随时间延长迅速增加，8 h 后，已由初始的13.28 mg/g 增至59.55 mg/g。而4℃条件下，TCA 可溶性蛋白含量增速平缓。这说明随测试范围内，蛋白酶系随温度的升高而呈现活力增大的趋势。

氨基酸态氮的变化趋势与TCA 可溶性蛋白基本一致，但氨基酸态氮的含量较低，初始值为0.05 mg/g，20℃条件下8 h 后也仅为0.14 mg/g，与TCA 可溶性蛋白含量相比显著偏低（P<0.01），这说明南极磷虾自溶初期主要是大分子蛋白被降解为肽类，而自溶酶系分解蛋白质产生的游离氨基酸非常有限。

图1 南极磷虾在4℃和20℃条件下NPN 含量的变化

图2 南极磷虾在4℃和20℃条件下TCA 可溶性蛋白与氨基酸态氮含量的变化

2.3 南极磷虾自溶过程中TVB-N 含量变化

南极磷虾TVB-N 初始值为0.08 mg/g。4℃条件下，南极磷虾在前2 h 之内TVB-N 值变化不大，2 h后缓慢增加，在8 h 后达到0.16 mg/g。20℃条件下，TVB-N 含量在前1 h 内变化不大，1 h 后TVB-N 随时间延长迅速增加，至8 h 时，已达到0.21 mg/g。我国对水产鲜活品TVB-N 的限量值为<0.30 mg/g，南极磷虾在20℃条件下8 h 时TVB-N 含量已超过0.20 mg/g，表明实际生产中应尽快加工，避免高温条件下长时间贮存。

3 讨 论

图3 南极磷虾在4℃和20℃条件下TVB-N 值的变化

由凯氏定氮法测得南极磷虾氮元素含量为25.36 mg/g，折合粗蛋白含量为15.85%（湿基计），说明南极磷虾是一种典型的高蛋白海洋动物，这与Tou 等[10]的研究结果类似。南极磷虾体内含有活性很高的蛋白酶系，肌肉蛋白易发生自溶降解，生成小分子物质[11]。NPN 是指大分子蛋白质以外的含氮化合物的总称，既包括蛋白质降解产生的小分子肽类和游离氨基酸，也包含了酰胺类、氨以及铵盐等含氮化合物[12]，因此适宜作为评判南极磷虾自溶进程的指标。TCA 可以沉淀大分子蛋白质，分子量小于10 000 的多肽组分则可以溶解在TCA 溶液中，因此TCA 可溶性蛋白含量的变化可以很好的表征南极磷虾自溶初期蛋白质发生的水解作用。南极磷虾自溶酶系包含了类胃蛋白酶、羧肽酶A 和类胰蛋白酶，其最适pH 值分别为3.0、6.0 和8.0，最适温度在40～60℃之间[3]。在0～20℃区间范围内，蛋白酶系随温度的升高而呈现活力增大的趋势。因此，20℃条件下，南极磷虾肌肉蛋白被迅速降解，生成大量的肽类，导致TCA 可溶性蛋白的大量增加。而4℃条件下，南极磷虾蛋白酶系活力受到抑制，多肽的生成量较少。南极磷虾的腐败过程可分为两个阶段，第一阶段主要为南极磷虾的自溶水解，自溶酶系分解蛋白质产生小分子肽类、游离氨基酸等组分；第二阶段则主要是內源酶和微生物共同作用，产生挥发性的含氮化合物，造成TVB-N、TMA 等含量的大幅增加。TVB-N 是指动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中蛋白质分解而产生的氨以及胺类等碱性含氮物质[13]。TVB-N 一般随着鲜度的下降而增加，因此被广泛作为反映鱼、贝、虾类等水产品腐败程度的重要指标。

4 结 论

（1）南极磷虾自溶过程中，NPN 含量随着时间的延长而增加，8 h 后4℃和20℃试验组NPN 含量分别为8.40 和12.67 mg/g，分别占到总氮的33.12%和49.96%，表明南极磷虾具有活力很高的自溶酶系，而低温可以在一定程度上抑制自溶酶系的活力。

（2）TCA 可溶性蛋白的变化规律与NPN 基本一致，而氨基酸态氮含量显著偏低（P<0.01），表明南极磷虾自溶初期主要是大分子蛋白被降解为肽类，而自溶酶系分解蛋白质产生的游离氨基酸非常有限。

（3）南极磷虾TVB-N 值同样随着时间延长而增加，8 h 后4℃和20℃试验组TVB-N 含量分别为0.16和0.21 mg/g。在实际生产中，南极磷虾原料应尽量避免高温条件下长时间贮存。

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