不同发酵阶段红曲黄酒滋味品质变化的比较研究

郭　壮，蔡宏宇，李建美，王玉荣，朱作容，梁　英*（湖北文理学院化学与食品学院鄂西北传统发酵食品研究所，湖北襄阳441053）

不同发酵阶段红曲黄酒滋味品质变化的比较研究

郭壮，蔡宏宇，李建美，王玉荣，朱作容，梁英*
（湖北文理学院化学与食品学院鄂西北传统发酵食品研究所，湖北襄阳441053）

采用电子舌技术和多变量统计学方法相结合的手段，对不同发酵阶段红曲黄酒的滋味品质进行了评价。结果表明，发酵过程中红曲黄酒的基本味均会发生显著的变化，其中发酵0～3 d时其变化最为明显。通过非线性多维标度分析和聚类分析发现，按照滋味整体结构相似性的大小可将其发酵过程划分为0～3 d，3～9 d和9～15 d三个阶段。通过多元方差分析发现发酵3～8 d和9～15 d的红曲黄酒其滋味品质整体结构存在显著差异，使用冗余分析进一步分析发现该差异是由于鲜味、丰度（鲜味回味）以及涩味等三个指标导致的。由此可见，发酵3～9 d可能是红曲黄酒滋味品质形成的关键阶段。

红曲黄酒；电子舌；发酵过程；品质评价

红曲黄酒通常以糯米为主要原料，通过添加红曲经糖化发酵酿制而成，其成品色红、味醇、香浓，是我国黄酒中十分有特色的一类产品［1］。作为红曲黄酒酿造中常用的功能活性酒曲，红曲中含有的红曲霉在生长代谢过程中可以产生γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、莫纳可林K（Monacolin K）和红曲色素等多种生理活性物质，现代研究成果表明，这些物质具有降血脂［2］和抗肿瘤［3］的功效。近年来，国内研究人员在红曲黄酒新产品开发［4-5］、香气成分构成［6］、生产工艺条件优化［7-8］和发酵醪液中微生物多样性揭示［9］等方面开展了大量卓有成效的研究。但目前国内关于红曲黄酒尤其是不同发酵阶段红曲黄酒滋味品质评价的研究报道尚少。

郑翠银等［10］运用定量描述分析法对4个类型的12种市售福建红曲黄酒进行了感官鉴定，得到了描述红曲黄酒滋味的滋味轮，同时确定了红曲黄酒滋味特征语言库，构建了一个独立、科学、有效的红曲黄酒滋味品质的评价体系。除了采用感官鉴评的方法外，研究人员亦可以采用电子舌对红曲黄酒的滋味品质进行评价。通过采用人工脂膜传感器技术，电子舌可以实现食品或药品的苦、涩、鲜、咸和酸5个基本味及苦、涩和鲜3个基本味的回味指标的测定，具有感受阈值和感知味强度与人保持一致，结果准确可靠的优点［11］，目前已在酒的产地鉴别［12-13］、品种鉴别［14-15］和酒龄识别［16-17］等方面有了广泛的应用，但其在红曲黄酒中的应用报道还尚少。

为了对红曲黄酒发酵过程中的滋味品质变化进行揭示，本研究拟每隔24 h对发酵中的红曲黄酒样品进行采集，累计持续15 d，同时拟采用电子舌技术和多元统计学方法相结合的方法，研究红曲黄酒发酵过程中各滋味指标强度的变化规律，分析不同发酵时间红曲黄酒滋味品质整体结构的差异性，并对与其滋味品质整体结构差异显著相关的指标进行鉴定。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

糯米：襄阳市天天福超市；酒曲：丽水力克生物科技有限公司；内部溶液、参比溶液、阴离子溶液、阳离子溶液：日本Insent公司；硫酸铜（分析纯）、酒石酸钾钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、次甲基（分析纯）、葡萄糖（分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司；盐酸（分析纯）：洛阳市化学试剂厂。

1.2仪器与设备

SA 402B电子舌：日本Insent公司；4盘电汽蒸饭柜：山东上美厨房设备厂；LRH-150生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；SHZ-D水循环多用真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；PHS-25 pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；KDM可调控温电热套：山东鄄城华鲁电热仪器有限公司；CL-1磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3方法

1.3.1红曲黄酒的制作

糯米经浸泡、蒸熟、摊凉和淋冷等操作后，添加25 g酒曲/1 000 g糯米将两者搅拌均匀，并添加煮沸冷凉的2.5倍糯米质量的纯净水，置于储酿罐中28℃发酵15 d。红曲黄酒发酵过程中每隔24 h取样一次，分别编号为发酵1 d至发酵15 d，同时将未发酵的样品进行留样，编号为发酵0 d。

1.3.2黄酒样品的预处理

取200 g红曲黄酒样品，3 000g×离心10 min后取上清液抽滤，滤液备用。

1.3.3使用电子舌对红曲黄酒样品进行测定

参照文献［18］的方法，使用电子舌对不同发酵时间红曲黄酒样品的酸、苦、涩、鲜和咸5个基本味及苦、涩和鲜3个基本味的回味进行测定。即传感器首先在参比溶液中测得参比溶液电势Vr；然后测得样品溶液电势Vs，通过不同传感器Vs-Vr的电势差值得到5个基本味的强度值；经洗涤后，传感器于参比溶液中检测到电势Vr'，通过Vr'-Vr的电势差值得到3个回味的强度值。每个样品重复测4次，选取后3次测量各滋味值的相对强度作为本研究分析的原始数据。将发酵0 d样品的各滋味强度均定义为0，待测样品的滋味值减去发酵0 d样品的滋味值即为相对强度。

1.3.4统计分析

使用多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）对各滋味指标的差异性进行分析；使用非线性多维标度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）和聚类分析（cluster analysis，CA）对不同发酵时间红曲黄酒滋味品质整体结构的差异性进行分析，使用欧氏距离（Euclidean distance）对红曲黄酒发酵3～8 d和9～15 d时滋味品质整体结构的组间差异进行分析，使用Mann-Whitney分析和冗余分析（redundancy analysis，RDA）对与上述两个时间段红曲黄酒滋味品质整体结构差异显著相关的指标进行分析。RDA分析采用canoco 4.5软件，其他分析均采用Matlab 2010b软件。

2　结果与分析

2.1红曲黄酒发酵过程中各滋味指标强度的变化

由表1可知，发酵过程中红曲黄酒样品的酸、苦、涩、鲜和咸5个基本味强度变化非常显著（P＜0.01）。由总变异值的大小可知，红曲黄酒发酵中酸味的变化幅度最大，其次为鲜味、咸味和苦味，而涩味的变化幅度较小。由极差可知，上述5个指标的极差值均大于1，即不同发酵时间段的红曲黄酒样品其滋味品质的差异即使通过感官鉴评也可以区分出来。值得一提的是，发酵过程中黄酒样品的后味A（涩的回味）、后味B（苦的回味）和丰度（鲜的回味）等3个回味指标变化不显著（P＞0.05）。

表1　红曲黄酒发酵过程中各滋味指标强度差异性的分析（n=16）Table 1 The significance analysis of each taste index of red-kojic rice wine in different fermentation time（n=16）

黄酒中的酸以乳酸和乙酸为主，同时又含有焦谷氨酸、琥珀酸和酒石酸等有机酸类，其具有增强黄酒浓厚味的作用［19］。红曲黄酒的酿造实质是一个开放式的发酵过程，由乳酸菌、霉菌和酵母菌等多种微生物共同参与完成［20］。乳酸菌在黄酒的发酵过程中起着极为重要的作用，其代谢产生的有机酸是风味物质的主要来源，同时产生的细菌素亦可以抑制部分杂菌的生长［21］。KIM S Y等［22］使用变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技术发现15份韩国米酒Takju中均含有Lactobacillus paracasei、Lactobacillus plantarum和Leuconostoc pseudomesenteroide等乳酸菌。由此可见，红曲黄酒发酵中酸味的变化幅度最大，这在一定程度上说明在发酵过程中乳酸菌的种类和数量可能会产生较大的变化。然而令人遗憾的是，目前关于黄酒尤其是红曲黄酒发酵过程中乳酸菌群落结构动态变化的研究报道尚少。因此，后期采用DGGE等指纹图谱技术或高通量测序技术［23］，同时结合实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polyerase chain reaction，qPCR）技术对不同发酵阶段红曲黄酒发酵醪液中的乳酸菌的丰度和多样性进行研究是极为必要的。红曲黄酒发酵过程中基本味和回味指标强度变化曲线见图1。

图1　红曲黄酒发酵过程中基本味（A）和回味（B）各滋味指标强度变化曲线Fig.1 Change curve of abundance of each taste index of basic taste（A）and after taste（B）in different fermentation time of red-kojic rice wine

由图1（A）可知，发酵过程中红曲黄酒的酸味强度不断增强，而苦味呈现出相反的趋势，但其增强或下降的趋势在0～3 d时最为明显。红曲黄酒发酵过程中涩味、咸味和鲜味均呈现出先下降再上升的趋势，其中涩味、咸味和鲜味强度的最小值分别出现在发酵1 d、2 d和3 d时。值得一提的是，发酵过程中黄酒的涩味在3 d时变化趋势趋于稳定，且趋向于零。由此可见，发酵0～3 d时红曲黄酒滋味品质的各滋味指标变化均较为明显。由图1（B）可知，发酵过程中红曲黄酒涩味、苦味和鲜味的回味变化趋势不明显。

黄酒中的苦味主要来源于发酵过程中微生物代谢所产生的高级醇、酪醇、氨基酸和二肽等物质［24］。当发酵醪液受到污染时，酵母菌和乳酸菌共同作用产生的丙烯醛，会使黄酒有较大的持续性的苦味［25］。此外，如果酒曲添加量过多或发酵温度过高均会导致酵母自溶后产生大量氨基酸，从而引起高级醇含量的升高以及酪醇的生成，进一步导致了黄酒苦味的产生［26］。

2.2不同发酵时间黄酒滋味品质整体结构的差异性分析

滋味是多种滋味物质相互作用的结果，其相互作用包含相杀、中和、加成作用等［27］，因此仅孤立的对红曲黄酒的某一个滋味指标进行评价是不足的。在对红曲黄酒发酵过程中各滋味指标丰度的变化进行研究的基础上，本研究进一步以不同发酵时间黄酒样品滋味指标的测量数据为研究对象，采用NMDS、CA和MANOVA等多元统计学方法对其滋味品质整体结构的变化进行了分析。

图2　不同发酵时间红曲黄酒样品非线性多维标度分析排序图Fig.2 Non-metric multidimensional scaling sequencing graph of red-kojic rice wine in different fermentation time

作为一种多维尺度图示分析技术，通过利用有序测量尺度，NMDS可将不同样品之间的相似距离用低维空间中点与点之间的距离表示出来［28］。由图2可知，不同发酵时间的样品空间排布呈现出一定的聚类趋势，其中未发酵、发酵1 d和2 d的样品均位于第四象限，发酵3～8 d的样品均位于第二或第三象限，而发酵9～15 d的样品均位于X轴正方向或第一象限。这说明未发酵、发酵1 d和2 d的样品其滋味品质整体结构较为相似，同理9～15 d的样品亦较为相似。发酵3 d与发酵2 d和4 d时的样品空间距离较远，同时发酵8 d与发酵7 d和9 d时的样品也呈现出相同的趋势，因此可以初步推断，红曲黄酒在发酵3 d时其滋味品质整体结构开始形成，而在发酵9 d时趋向于稳定，发酵3～9 d时可能是红曲黄酒滋味品质形成的关键阶段。

未发酵、发酵1 d和2 d的样品及发酵9～15 d的样品其空间排布较为集中，而发酵3～8 d的样品排布较为分散，这说明发酵3～8 d时红曲黄酒的滋味品质变化明显，而发酵9 d以后其滋味变化趋势减缓，这一点在图1中也得到了证实。本研究采用欧式距离分别计算了发酵3～8 d和9～15 d时红曲黄酒样品组内滋味品质整体结构的平均距离，结果发现其组间距离分别为3.21±0.74和2.61±0.65（X¯±SD），然而经Mann-Whiney检验发现两者差异均不显著（P＞0.05）。

为了进一步验证NMDS分析的结果，采用马氏距离聚类对不同发酵阶段红曲黄酒的滋味品质整体结构进行了分析，结果见图3。由图3可知，当平均距离取10的时候，16个红曲黄酒样品可以分成三个聚类，其中未发酵和发酵1 d的样品可以形成第一个聚类，发酵2 d的样品单独形成第二个聚类，而发酵3～15 d的样品可以形成第三个聚类。由此可见，发酵0～3 d时红曲黄酒滋味品质整体结构变化均较为明显，这与图1观察到的结果是一致的。值得一提的是，当平均距离取7时，上述第三个聚类可以进一步分为两个小的聚类，其中第一个小聚类由发酵3～8 d的红曲黄酒样品组成，第二个聚类由发酵9～15 d的样品组成。本研究进一步采用MANOVA对发酵3～8 d和9～15 d的红曲黄酒滋味品质的差异性进行了分析，结果发现两个时间段的黄酒样品其滋味差异显著（P＜0.05）。由此可见，发酵8～9d时红曲黄酒的滋味品质整体结构可能会发生较显著的变化。综上所述，发酵3～9 d可能是红曲黄酒滋味品质形成的关键阶段。

图3　基于马氏距离不同发酵时间红曲黄酒滋味品质的聚类分析Fig.3 Cluster analysis of the taste profile characterization of red-kojic rice wine in different fermentation time based on mahalanobis distance

2.3发酵不同阶段红曲黄酒滋味品质整体结构差异显著相关指标的鉴定

图4　冗余分析双序图Fig.4 Double sequence diagram of redundancy analysis

通过上述分析证实发酵3～9 d可能是红曲黄酒滋味品质形成的关键阶段，由图1发现发酵0～3 d时红曲黄酒各滋味指标的变化趋势，而究竟是因为哪些指标的不同导致了发酵3～8 d和9～15 d黄酒样品滋味品质整体结构具有显著差异是需要进一步研究的问题。通过解释变量的线性组合，RDA可以尽最大可能解释响应变量的变异度［20］。在上述分析中，通过采用MANOVA证实了发酵3～8 d和9～15d的红曲黄酒滋味品质存在显著的差异，因而在RDA分析中，以红曲黄酒的不同发酵阶段（3～8 d/9～15 d）作为起约束作用的解释变量，用于预测和解释全部8个滋味指标数据组成的响应变量。由图4可知，鲜味、丰度（鲜味回味）以及涩味等3个指标与RDA排序图约束轴上的样本赋值良好相关，由此可见，正是上述3个指标代表了发酵3～8 d和9～15 d时黄酒样品滋味品质总体结构差异显著相关的关键滋味。由图4亦可知，鲜味和丰度（鲜味回味）指标位于图的左边（即发酵9～15 d）而涩味位于右边（即发酵3～8 d），这说明随着发酵时间的延长，发酵9～15 d的红曲黄酒其鲜味及鲜味的回味强度较之3～8 d时高，而涩味呈现出相反的趋势。经Mann-Whitney检验发现，上述3个滋味指标在两个发酵时间段的红曲黄酒样品中差异具有统计上的显著性（P＜0.01）。

3　结论

通过采用电子舌对不同发酵阶段红曲黄酒的基本味和回味进行测定，结果表明：发酵过程中红曲黄酒的酸味、苦味、涩味、鲜味和咸味均会发生显著的变化，而回味变化不显著。按照红曲黄酒滋味整体结构相似性的大小，可以将红曲黄酒的发酵过程划分为0～3 d，3～9 d和9～15 d三个阶段，其中发酵3 d后红曲黄酒的整体滋味品质开始形成，发酵9 d后趋向于稳定，因而3～9 d可能是红曲黄酒滋味品质形成的关键阶段。

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Comparative study on the taste profile characterization of red-kojic rice wine in different fermentation time

GUO Zhuang，CAI Hongyu，LI Jianmei，WANG Yurong，ZHU Zuorong，LIANG Ying*
（Northwest Hubei Research Institute of Traditional Fermented Food，College of Chemical Engineering and Food Science，Hubei University of Arts and Science，Xiangyang 441053，China）

The taste profile characterizations of red-kojic rice wine in different fermentation period were studied by electronic tongue and multivariate statistics.Results indicated that there were significant changes of basic taste of red-kojic rice wine in different fermentation time，especially during 0-3 d.Through nonlinear multidimensional scaling and cluster analysis，the fermentation process of red-kojic rice wine could divided into three stages based on the taste profile similarity，namely 0-3 d，3-9 d and 9-15 d.Multivariate analysis of variance showed that there was significant difference in the taste profile characterization of red-kojic rice wine fermented at 3-8 d and 9-15 d.Meanwhile，umami，richness，and astringency were identified by redundancy analysis as key variables significantly associated with the taste profile difference.Thus，it can be concluded that fermentation period of 3-9 d was probably a key state for taste profile formation.

red-kojic rice wine；electronic tongue；fermentation process；quality evaluation

TS262.4

A

0254-5071（2015）11-0056-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.013

2015-10-13

湖北省教育厅科学技术研究计划中青年人才项目（Q20152603）

郭壮（1984-），男，讲师，博士，研究方向为食品生物技术。

梁英（1967-），女，教授，博士，研究方向为绿色化学与生物质工程技术。