人脂肪干细胞的培养及鉴定

尚志刚，郭琼，李甜，白生宾，钟近洁，秦纹，冯树梅

（1.新疆医科大学新疆乌鲁木齐830000；2.新疆医科大学人体解剖与组织胚胎学教研室新疆乌鲁木齐830000）

人脂肪干细胞的培养及鉴定

尚志刚1，郭琼2，李甜2，白生宾2，钟近洁2，秦纹2，冯树梅2

（1.新疆医科大学新疆乌鲁木齐830000；2.新疆医科大学人体解剖与组织胚胎学教研室新疆乌鲁木齐830000）

目的：探讨人脂肪干细胞的分离、培养并鉴定。方法：采用胶原酶法消化人脂肪组织，培养原代脂肪干细胞，通过多种方法检测鉴定。结果：细胞贴壁生长，形态呈梭形，并呈旋涡状或放射状排列；细胞生长曲线为典型的“S”形，细胞倍增时间为26h。流式细胞仪检测结果显示CD29、CD105、CD44为阳性；CD45为阴性；成脂诱导分化的细胞经油红O染色为阳性，成骨诱导分化后茜素红染色亦为阳染。结论：通过获取人腹部脂肪组织进体外分离培养及鉴定，证实其为脂肪干细胞。

脂肪干细胞；分离培养；鉴定

脂肪干细胞是近年来组织工程学研究的热点，目前认为，它是一群成纤维细胞样的基质干细胞，具有多向分化潜能［1］，体外实验证明脂肪干细胞经过体外诱导后，具有成脂分化能力、成骨分化能力、成软骨细胞分化能力、成骨骼肌细胞分化能力、成心肌细胞分化能力、成内皮细胞分化能力、成神经细胞分化能力等，是一种具有多谱系、多胚层分化能力的干细胞［2-3］。本研究将手术获取的人脂肪组织进行分离培养，将传代后的细胞进行多向分化诱导，为进一步研究脂肪干细胞的分化提供实验基础。

图1　第4代、第6代、第11代脂肪干细胞形态

1　资料和方法

1.1人脂肪干细胞（hADSCs）的分离及培养

通过外科手术获得患者的腹部脂肪，排除脂肪瘤等疾病，已签署同意书。将得到的脂肪组织剪成0.1cm×0.1cm×0.1cm大小组织，用0.1mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后置入瓶中，以4倍脂肪组织体积的胶原酶I消化，反复将脂肪组织剪碎至糊状后，37℃摇匀30min，用250μl尼龙纱网将消化后的脂肪组织过滤入离心管中，1000r/min离心30 min，弃去上清液和悬浮的脂肪碎块，沉淀重悬于0.075mmol/L氯化钾，静置10min后离心，弃去上清，沉淀重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，移入培养皿中，置于37℃，5%CO2温箱，以100%湿度进行培养。隔天更换培养液。待细胞铺满约90%培养皿底部面积后，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3的比例进行传代。

1.2人脂肪干细胞（hADSCs）的生物学特性检测

1.2.1人脂肪干细胞（hADSCs）的形态学观察：倒置显微镜下观察不同时间脂肪干细胞的生长特点、形态。

1.2.2人脂肪干细胞生长曲线：取第8代脂肪干细胞，消化法消化细胞后，调整细胞悬液浓度为1.5× 105/L接种于24孔板，每天随机取4孔细胞消化、记数，连续7d，以时间为X坐标，细胞数为Y坐标，绘制细胞生长曲线（图1）。

1.2.3干细胞表面标记物：取第3代细胞，用流式细胞仪检测CD14、CD29、CD44、CD45、CD105。

1.2.4成脂肪诱导及鉴定：加入成脂诱导液，配置含10%FBS的HG-DMEM培养液，在配制完成的HGDMEM培养液中，加入1μM地塞米松，10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；准备6孔培养板，将第三代脂肪干细胞按照2×104个/cm2的规格接种于原始HG-DMEM培养液中待细胞长至基本融合后，每2～3d换液。诱导两周后，油红O染液染色，倒置显微镜下观察染色情况，拍照。

1.2.5成骨诱导及鉴定：加入成骨诱导液，准备含10%FBS的α-MEM培养液，在备好的α-MEM培养液中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、地塞米松，50μmol/L抗坏血酸。准备6孔培养板，将第三代脂肪干细胞按照5×103个/cm2的规格接种于原始α-MEM培养液中，置于37℃、5%CO2和100%湿度温箱中培养。待细胞长至基本融合后，更换上述制备完成的成骨诱导培养液。28d后再进行矿化结节的茜素红染色，用倒置显微镜下观察染色情况，拍照。

2　结果

2.1人脂肪干细胞（hADSCs）的形态学观察

倒置显微镜下观察，原代脂肪干细胞培养24h后就有少量细胞贴壁，细胞呈短小的梭形或多角形，均为单细胞核，胞核位于细胞中央。24h首次换液，换液后细胞生长迅速。3～4d后可见细胞梭形逐渐变长，多角形逐渐消失，2～3d天左右换液，经传代10次后，观察形态较饱满、均一，多呈长梭性。增殖速度在1:2的分种率下在72h左右可长满，形态亦多呈长梭性，呈极性排列。

2.2细胞生长曲线

细胞倍增时间为26h。细胞增殖曲线呈现典型的“S”形，在接种的前3d内细胞处于生长的停滞期，3～6d进入对数增长期，6d达到生长峰，至第7天细胞增殖速度明显变缓，进入增殖平台期（图2）。

图2　脂肪干细胞生长曲线

2.3流式细胞仪检测

用流式细胞仪检测脂肪干细胞表面分子CD14、CD29、CD44、CD45、CD105。其中CD14和CD45为阴性，CD29、CD44、CD105为阳性（图3）。

2.4成脂诱导分化

细胞贴壁100%汇合后，加入间质干细胞成脂诱导液，成脂诱导约3d后，细胞内开始出现小脂滴。随后细胞的外形也逐渐由长梭形变为圆形或多边形，细胞内脂滴数量逐渐增加，并有相互融合的趋势，经油红O染色显示可见脂质沉积（图4）。

2.5成骨诱导分化

细胞贴壁约70%汇合后，加入间质干细胞成骨诱导液，诱导培养3d后，细胞的形态由长梭形逐渐呈短梭形或多角形；诱导7d后，胞质内细胞颗粒增多，细胞呈多角形；4周后，逐渐失去正常的细胞结构，钙结节形成明显，经茜素红染色呈红色结节（图5）。

图3　脂肪干细胞表面分子鉴定结果

3　讨论

随着分子生物技术和细胞生物技术的进步，很多学者将目光投向了细胞治疗技术，认为这一全新的领域将为许多疾病的治疗打开崭新的篇章［4］。有研究表明，利用间充质干细胞移植技术治疗疾病时，平均每千克体重大约需要移植2×106个细胞［5］。具体到一些内科疾病上，在心内科，如果想利用骨髓间充质干细胞移植技术治疗治疗心肌梗死，医生需要为每个患者移植的2.36×108个细胞；在消化内科，如果想利用骨髓间充质干细胞移植技术治疗治疗克罗恩氏病时，医生需要为每个患者移植约3× 107个细胞［6］。但是根据目前的实验室技术手段，要想得到5000个脂肪干细胞就会耗费约一克的脂肪组织。鉴于实际治疗上的要求，要想在临床工作当中取得满意的治疗效果，则必须对脂肪干细胞进行高质量的体外扩增。然而，干细胞的相关研究认为，过多的传代会对细胞的增殖和分化能力造成影响，这会影响干细胞特性［7-10］。与此相互印证的是临床治疗后长期跟踪的结果显示，要想获得更高的治疗成功率，就要在治疗时尽量选用接近原代的干细胞进行移植接种。综上所述，满足临床需求的干细胞扩增方法是要尽量延长培养时间，在每一代培养中获得更多的细胞。然而，对这些细胞进行不传代的长期培养是非常困难的，但是脂肪干细胞能够耐受接触抑制［11］，有研究改良了传统的5d传代的干细胞培养方法，认为每14d才进行传代反而能够获得更高质量的干细胞。因此，实践并探索各种脂肪干细胞的分离、培养及鉴定方法，不断积累经验，有助于进行后续对脂肪干细胞分化能力的控制研究提供实验的基础材料。

总之，在本次试验研究中，分离培养的脂肪干细胞形态正常，生长曲线符合脂肪干细胞的特征，流式细胞仪检测结果显示CD105、CD29、CD44为阳性；CD45、CD14为阴性；培养的脂肪干细胞具有成脂分化和成骨分化的能力。根据以上检测结果，可以确定该细胞为脂肪干细胞。

图5　茜素红染色，钙结节形成

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Isolation and identification of human adipose stem cells

SHANG Zhi-gang1，GUO Qiong2，LI Tian2，BAI Sheng-bing2，ZHONG Jin-jie2，QIN Wen2，
FENG Shu-mei2
（1.Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，Xinjiang，China；2.Department of histo-embryology，Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，Xinjiang，China）

Objective To establish an effective method on isolating and identifying Human adipose stem cells（hADSCs）.Methods Collagenase digestion was adopted to isolate stem cells from human adipose tissue.These isolated cells were subcultured and passaged in vitro，the morphology and cell growth curve were characterized subsequently.Moreover，flow cytometry and multi-lineage differentiation ability were identified.Results The obtained cells with spindle-shape were adherent monolayer cells，and were arranged in whirlpool or radiation.The cell growth curve was a typical“S”shape，indicating a 26h of doubling generation time.These cells are positive for CD29，CD105，CD44，negative for CD45 showed by Flow cytometry.The positive results of oil red and alizarin red staining also indicated that the obtained cells were pluripotent.Conclusion HADSCs could be obtained from human abodemen adipose tissue through a series of isolation and identified methods.

human adipose stem cells；isolation；identification.

Q813.1

A

1008-6455（2015）08-0034-04

冯树梅，女，副教授；主要研究方向：干细胞分化及其应用；新疆医科大学组织胚胎学教研室，邮编：830000