胚胎培养液中添加白蛋白对pH的影响

童叶华朱卫中

1. 开化县人民医院（浙江开化 324300）2. 丽水市人民医院

胚胎培养液中添加白蛋白对pH的影响

童叶华1朱卫中2*

1. 开化县人民医院（浙江开化 324300）2. 丽水市人民医院

目的 了解胚胎培养液添加白蛋白对pH的影响。方法 在HTF受精液、CM卵裂液、G1卵裂液和CSC全程培养液中添加不同浓度的白蛋白制剂，在经过5.0% CO2过夜平衡后用血气分析仪检测其HCO3-浓度和pH。结果 白蛋白制剂的HCO3-浓度明显低于培养液；培养液中添加白蛋白会降低HCO3-浓度和pH，白蛋白浓度与pH呈高度负相关（P＜0.01）；不同品牌培养液的pH，模型存在较明显差异，HTF和CM的pH明显低于G1和CSC（P＜0.01）。结论 胚胎培养液中添加白蛋白会降低pH且与培养液的品牌相关，应通过实测胚胎培养液的pH来确定CO2浓度，尤其是搭配使用不同品牌产品的时候，仅仅依靠经验或厂家提供的参数是不可靠的。

培养基; 白蛋白类; 氢离子浓度; 二氧化碳

维持培养体系适宜而稳定的酸碱度，是影响体外受精-胚胎移植（IVF-ET）结局的关键因素之一；胚胎培养液通常采用碳酸氢盐/碳酸缓冲体系，在一定浓度CO2气体的支持下，CO2与水反应生成碳酸，碳酸与培养液中的碳酸氢盐组成HCO3-/H2CO3的共轭酸碱缓冲体系以维持合适的pH[1]。当培养液的HCO3-或H2CO3浓度发生变化，其比值会发生变化，最终导致培养液的pH值发生改变。

白蛋白制剂是胚胎实验室最常用的试剂，是胚胎培养液和移植液的主要营养物质之一；白蛋白具有防止配子和胚胎粘附、中和毒素和稳定胶体渗透压的作用，使用体积浓度为5%～20%[2,3]。胚胎培养液在添加了不同浓度的白蛋白后，其HCO3-浓度受到稀释，在恒定CO2浓度气体支持下的pH也会发生改变。长期以来由于缺少相关的实验数据，人们在胚胎培养液、移植液中添加白蛋白通常凭借自身经验或个人喜好，具有一定的盲目性。为了解添加了不同种类和不同浓度的白蛋白对不同品牌胚胎培养液pH的影响，我们进行了相关的研究与分析。

材料与方法

一、胚胎培养液与白蛋白制剂

1. In VitroCare HTF受精液（以下简称HTF），批号I15M104L。

2. Quinn,s Cleverage Medium卵裂液（以下简称CM），批号E112B。

3. Vtrolife G1卵裂液（以下简称G1），批号504468。

4. IrvineScientifc Contimous Single Cultuer全程培养液（以下简称CSC），批号90164010604。

5. Quinn,s HSA人血白蛋白（以下简称HSA），白蛋白浓度：5.0%，批号GHSA13009E。

6. IrvineScientific SSS合成血清蛋白（以下简称SSS），白蛋白浓度：5.0%，批号99193140101。

二、仪器设备

1. 美国Forma 3121型二氧化碳培养箱。

2. 日本K-1 System胚胎操作箱，以5.0% CO2气体支持。

3. 德国IN CONTROL 1050 二氧化碳测定仪。

4. 丹麦雷度ABL 80 FLEX型血气分析仪。

5. 天津斯格瑞SMC 30C渗透压测定仪。

三、检测方法

1. 取8组14mL 的BD试管各5支，编号，在1～2组、3～4组、5～6组、7～8组试管中分别加入HTF、CM、G1、CSC胚胎培养液5.0mL、4.75mL、 4.50mL、4.25mL和4.00mL，然后在1、3、5、7组的各5支试管中分别加入5.0%HSA 0ml、0.25ml、0.5mL、0.75mL、1.0mL，在2、4、6、8组的各5支试管中分别加入5.0%SSS 0mL、0.25mL、0.5mL、0.75mL、1.0mL，混匀。各组胚胎培养液添加的白蛋白体积浓度（V/V）分别为0%、5.0%、10.0%、15.0%和20.0%。

2. 将各组试管松盖，放入37.0℃、5.0% CO2培养箱，过夜平衡（气体平衡时间18h）。CO2培养箱用二氧化碳测定仪进行日常检测。

3. 将平衡后的试管分组从培养箱中取出，在胚胎操作箱中用1mL BD注射器吸取胚胎培养液，排除空气，封密，立即送检验科进行血气分析。

4. 血气分析仪完成校准和日常室内质控，对各胚胎培养液进行血气分析，重复二次结果，取均值。

5. 渗透压测定仪完成校准和日常室内质控，检测各胚胎培养液及白蛋白制剂的渗透压，重复二次结果，取均值。

四、结果统计

采用SPSS 12.0统计软件，进行相关性分析。

结 果

1. 各种胚胎培养液均为等渗液体，电解质及HCO3-浓度略有差异，与人体血清参考值比较接近；胚胎培养液在5.0% CO2气体平衡后的pH在7.325～7.420之间。白蛋白制剂HAS、SSS均为等渗液体，但HCO3-浓度明显低于培养液，故在5.0% CO2气体平衡后的pH低于6.80。各种胚胎培养液及白蛋白制剂经过5.0% CO2平衡后的血气分析及渗透压测定结果见表1。

表1 各种胚胎培养液及白蛋白制剂经过5.0% CO2平衡后的血气分析及渗透压测定结果

2. 各种胚胎培养液随着白蛋白浓度的提高，HCO3-浓度逐渐降低，其pH值均呈降低趋势，pH值与培养液添加的白蛋白浓度呈高度负相关关系（r =-0.972～-0.994，P＜0.01）。HTF、CM的pH值比G1、CSC整体减低，其差值随着白蛋白浓度的增高而降低，添加体积浓度10%白蛋白的HTF和CM的pH值比G1和CSC明显减低（P＜0.01），差值在0.05以上。添加HSA与添加SSS的培养液的pH值无显著性差异（P＞0.01）。胚胎培养液HTF、CM、G1、CSC添加不同浓度白蛋白制剂HSA、SSS的pH变化见表2。

表2 胚胎培养液HTF、CM、G1、CSC添加不同浓度白蛋白制剂HSA、SSS的pH变化

讨 论

胚胎实验室所用的白蛋白制剂主要有人血清白蛋白、重组白蛋白和大分子混合物，IrvineScientific合成血清蛋白SSS属于后者，是84%人血清白蛋白与16%α球蛋白、β球蛋白的混合物[3]。白蛋白制剂为等渗液体，加入胚胎培养液后不会改变液体总的渗透压，但会改变各成份的构成比例，其中就包括HCO3-浓度。

由于胚胎培养液中含有与血浆相当浓度的HCO3-，而白蛋白制剂中的HCO3-浓度很低，若将5%～20%的白蛋白添加到胚胎培养液中则相应降低了5%～20%的HCO3-浓度。本文结果显示在相同的胚胎培养中加入体积浓度20%的白蛋白比加入体积浓度10%的白蛋白在CO2平衡后的pH要低0.05以上，相当于将CO2浓度从5.0%提高至6.0%产生的降低pH的平衡效果[1]。

近年来，胚胎培养最佳pH为多少的问题引起了人们的高度关注。有人证实pH降至7.20以下受精率将减低[4]，还有人提出卵裂期胚胎较适宜的pH在7.00～7.30范围内[5]；Patrizio[6]确定受精、卵裂和囊胚培养的pH标准分别为7.30、7.20和7.30。目前一般认为受精、卵裂和囊胚培养的最适pH为7.20～7.30。

胚胎培养液HTF、CM、G1和CSC在5.0% CO2过夜平衡后的pH分别为 7.325、7.355、7.420和7.405，在添加体积浓度10%的白蛋白制剂后其pH均出现下降，其中HTF和CM的pH在7.260～7.285之间，而G1和CSC的pH在7.315～7.345之间，HTF和CM的pH要比G1和CSC的pH低0.05～0.06，表明HTF和CM需要的CO2浓度应低于G1和CSC。本文认为HTF和CM在添加体积浓度10%的白蛋白后过夜平衡的CO2浓度以（5.0～5.5）%为宜，而G1和CSC则需要5.5～6.0%的CO2浓度。

综上所述，胚胎培养液在添加不同浓度的白蛋白后会改变pH，应通过实测pH来确定酸碱度和CO2浓度是否合适，尤其是搭配使用不同品牌产品的时候，若仅仅依靠经验或厂家提供的参数是不可靠的。采用血气分析仪检测CO2平衡后的胚胎培养液，具有快速、简便和准确等优点，除pH外还可以同时得到HCO3-、电解质、葡萄糖及乳酸等具有参考价值的分析指标。

1 朱卫中, 胡京美, 叶明建. 影响胚胎培养液PH及二氧化碳平衡的因素探讨. 生殖医学杂志 2011; 20(3): 223-227

2 陈子江主编. 人类生殖与辅助生殖. 第1版. 北京: 科学出版社, 2005: 421-423

3 黄国宁, 孙海翔主编. 体外受精-胚胎移植实验室技术.第1版. 北京: 人民卫生出版社, 2012: 201-203

4 Miyamoto H, Toyoda Y, Chang MC. Effect of hydrogenion concentration on in vitro fertilization of mouse,golden hanmster and rat eggs. Biol Reprod 1974; 10(4): 487-493

5 Phillips KP, Leveille MC, Claman P, et al. Intracellular pH regulation in human preimplantation embryos. Hum Reprod 2000; 15(4): 896-904

6 Patrizio P, Tucker MJ, Guelman V. 人类辅助生殖彩色图谱:实验室与临床观念. 第1版. 天津: 天津科技翻译出版公司, 2005; 201-203

（2015-01-01收稿）

The effect of albumin on the pH value of embryo culture medium

Tong Yehua1, Zhu Weizhong2*
1. The People,s Hospital of Kaihua, Kaihua 324300,Zhejiang, China 2. The People,s Hospital of Lishui Corresponding author: Zhu Weizhong, E-mail: 7087807@163.com

Objective To explore the effect of albumin on the pH value of embryo culture medium. Methods Firstly, albumin with different concentrations were added into HTF, CM, G1 and CSC culture medium. Then these cultures were incubated in incubator with CO2of 5.0% overnight. Lastly, the concentration of HCO3-and pH value were detected using blood-gas analyzer. Results The concentration of HCO3-of albumin was signifcantly lower than that of cultures. Adding albumin into these cultures can reduce the concentration of HCO3-and pH value, and the concentration of albumin was highly negatively correlated with pH value (P＜0.01). The pH value of different culture was different, and the pH value of HTF and CM was signifcantly lower than that of G1 and CSC (P＜0.01). Conclusion Adding albumin into culture medium can reduce it's pH value, which may be related to different products of culture medium.It's not reliable to determine the concentration of CO2only based on experience or parameters provided by manufacturers, especially when using different culture product together. We should actually detect pH value of the cultures.

culture media; albumins; Hydrogen-Ion Concentration; Carbon Dioxide

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.06.006

R 321-33

*通讯作者, E-mail: 7087807@163.com