Ku70蛋白在肝细胞癌患者体内的表达规律及其意义

杨成林，李俊杰，孙学军

在世界范围内肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)死亡率在肿瘤中列第3位［1］。提高早期诊断是提升HCC疗效的关键。传统的超声、CT和MRI敏感性不够或价格昂贵，无法准确或大规模应用于其早期诊断或预后判断［2-3］。甲胎蛋白(a-Fetoprotein，AFP)是敏感性和特异性均较高的HCC血清标志物，但仍有30%患者血清AFP并未升高，因而临床应用有局限性［4］。在非小细胞型肺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、食管癌等组织及细胞系中，均发现有Ku70异常表达［5-13］。Ku80与乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)相关的HCC预后有密切关系［14-15］。但Ku70蛋白在HCC中的表达规律及其临床意义相关报道较少。因此，本研究收集106例HCC手术切除标本，检测Ku70蛋白在HCC患者体内的表达规律，并明确其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2005年1月—2011年5月我院手术治疗的106例HCC手术切除标本及临床资料。所有患者术后病理检查均为原发性HCC，且手术切缘无残存肿瘤细胞。其中男69例，女37例，年龄26～75(57.7±19.1)岁，中位年龄55岁。肝硬化98例、乙型病毒性肝炎95例、丙型病毒性肝炎7例、酒精性肝病4例;感染HBV时间49例＜10年，46例≥10年。肝癌分期I期34例，II期38例，III期27例，IV期7例。术前Child-Pugh分级A级66例，B级40例。病理高分化31例，中分化46例，低分化29例。随机收集92例肝血管瘤手术时切取的正常肝组织作为正常对照组，其中男56例，女36例，年龄(53.1±22.6)岁。两组患者的年龄及性别比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 标本收集与处理 通过肝癌根治术取癌组织和距离癌组织2 cm的癌旁组织。浸泡在4%甲醛溶液中固定24 h，而后常规石蜡包埋、切片，切片厚度4 μm。所有受试者均签署书面知情同意书，并由医院伦理委员会批准。

1.3 随访 随访采取门诊复查或电话。随访截止日期为2014年6月30日。随访周期为2～88(47.3±31.5)个月，中位时间为42个月。失访3例，其中男2例，女1例，均为HBV相关的HCC合并肝硬化。最终103例完成随访。每月检查AFP水平;每6个月行腹部B超检查。如果怀疑肿瘤复发，立即行CT和MRI检查确诊。

1.4 免疫组织化学染色及结果判定 以PBS代替一抗作为空白对照，以正常兔血清(武汉博士德生物工程有限公司)代替一抗作为阴性对照，采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶连接(SP)法染色。抗原修复液为0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。切片常规脱蜡至水，3%H2O2－甲醇溶液浸泡10 min，抗原微波热修复2～3次;山羊血清封闭10 min，加一抗(anti-Ku70单克隆抗体，美国Abcam公司)后置于4℃过夜;37℃复温45 min后加入二抗，37℃下孵育30 min，DAB显色5～10 min，苏木精衬染后脱水、透明、封片;普通光镜下观察结果。由两名高年资病理科医师在不知道任何临床和病理资料的情况下判读结果。Ku70蛋白的阳性效应产物为定位于细胞核的棕黄色颗粒［7］，细胞质或细胞膜呈现为轻度或阴性免疫反应。每张切片随机选择5个高倍镜视野，各计数100个细胞。观察细胞着色程度，未染色计0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。计算阳性细胞的百分比，＜5%为0分，6% ～25%为1分，25% ～50%为2分，51% ～75%为3分，76% ～100%为4分。两个得分相乘作为Ku70蛋白表达结果:阴性0分、弱阳性1～4分、阳性5～8分、强阳性9～12分，阳性率(%)=［1－(阴性表达例数/总例数)］×100%。根据最终的结果，定义0～4分低表达，5～12分高表达。

1.5 统计学分析 应用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，两样本之间的比较采用Student＇s t检验，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验或Fisher精确概率法。多因素分析采用非条件Logistic回归分析。Kaplan-Meier法进行生存分析，组间比较采用log-rank检验，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 组织标本中Ku70蛋白的表达检测结果Ku70蛋白的阳性表达信号主要位于细胞核，呈棕黄色颗粒状，染色均匀一致。在肝癌组织中，Ku70蛋白的阴性表达率为9.7%(10例)，弱阳性表达率为27.2%(28 例)、阳性表达率为37.9%(39 例)、强阳性表达率为25.2%(26例)，总的阳性表达率为90.3%。癌旁组织中，Ku70蛋白的阴性、弱阳性、阳性及强阳性表达率分别为30.1%(31例)、31.1%(32 例)、24.3%(25 例)和 14.5%(15 例)，总的阳性表达率为69.9%。92例正常肝组织中，Ku70蛋白的阴性、弱阳性、阳性及强阳性表达率分别为31.5%(29 例)、35.9%(33 例)、22.8%(21 例)和9.8%(9例)，总的阳性表达率为68.5%。与正常肝组织比较，肝癌组织和癌旁组织中Ku70蛋白的阳性、强阳性和总的阳性表达率均显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与癌旁组织比较，肝癌组织中Ku70蛋白的阳性、强阳性和总的阳性表达率显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 肝癌组织中Ku70蛋白表达与临床病理参数的关系 根据Ku70蛋白的表达情况，将103例HCC患者分为低表达组38例(36.9%)和高表达组65例(63.1%)。单因素分析表明，肝癌组织中Ku70蛋白的表达水平与Child-Pugh分级、肿瘤直径、肿瘤分化程度及 TNM分期有关(P=0.021、0.039、0.017、0.008)，见表 1。将上述单因素分析中有统计学意义的指标进行非条件Logistic回归分析。Y=0为Ku70低表达，Y=1为Ku70高表达。变量赋值如下:Child A级=0，Child B级=1;肿瘤大小:肿瘤直径＜2 cm为1，2～5 cm为2，＞5 cm为3;肿瘤低分化=1，中分化=2，高分化=3;I期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期 =3，Ⅳ期 =4。结果表明，Child-Pugh分级、肿瘤大小、肿瘤分化程度、TNM分期是HCC患者肝癌组织中Ku70蛋白表达水平升高的危险因素，见表2。

2.3 Ku70蛋白的表达水平与生存情况的关系 低表达组生存时间为(40.3±4.6)个月，中位生存时间为33个月，3年生存率为47.4%，5年生存率为21.1%;高表达组生存时间为(30.8 ±2.6)个月，中位生存时间为25个月，3年生存率为27.7%，5年生存率为7.3%。与高表达组比较，低表达组患者的生存时间显著延长(P＜0.05)。

表1 肝癌组织Ku70蛋白表达与临床病理参数的关系(例)

表2 影响肝癌组织中Ku70蛋白表达水平危险因素的分析

3 讨论

除AFP外，细胞间黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、γ-凝血酶原 (Desgamma carboxy-prothrombin，DCP)、人凝血酶原前体蛋白(Protein-induced vitamin K absence or antagonistII，PIVKA-II)、骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)等均被发现与HCC患者的预后有密切关系，但单独应用时，敏感性和特异性仍较为有限［16-19］。在AFP的基础上，联合其他分子标志物检测，是提高HCC诊断和预后判断准确率的可行方法［20］。

Ku70在修复DNA并维持基因组稳定性中发挥重要作用。目前发现，Ku70的生物学功能十分复杂，参与多种基因的表达与调控，与肿瘤的形成有密切关系［21］。Hu等［7］发现在非小细胞肺癌组织中，Ku70的表达显著升高;而高表达Ku70的患者，其临床分期较晚，出现淋巴结转移的比例较高，且生存时间较短。Alshareeda等［22］报道Ku70表达与乳腺癌患者较差的预后、较低的分化程度、淋巴结转移呈正相关。Ku70与消化系统肿瘤也存在类似的关系。Gasinska等［8］发现Ku70与女性结肠癌患者的TNM分期有关，表达水平越高TNM分期越高。Li等［11］发现与正常胃组织相比，胃癌组织中Ku70的阳性表达率显著升高。Sullivan等［12］发现在胰腺导管腺癌的肿瘤组织中，Ku70呈高表达趋势，且通过RNA干扰下调Ku70的表达，可显著降低胰腺导管腺癌细胞系 Mia PaCa-2的侵袭性。Yang等［13］发现Ku70与食管癌患者较差的预后、较高的TNM分期、较低的分化等级有直接关系;而在细胞水平中下调Ku70的表达，可促进细胞的凋亡。这些研究均表明，Ku70与消化系统肿瘤有着密切的联系，其可能在肿瘤发生、发展中发挥类似原癌基因的功能。近期亦有研究表明，与Ku70共同组成Ku蛋白的另一条多肽链Ku80，与HBV和HCV相关的HCC患者预后有密切关系［14-15］。但Ku70蛋白在HCC中的表达规律及其临床意义相关研究报道较少。

因此，本研究首先检测HCC患者手术切除标本中Ku70蛋白的表达情况，以确定Ku70与HCC的关系。与已有文献报道的结果相似，我们发现Ku70蛋白在肝癌组织中呈高表达趋势，且阳性结果出现于癌细胞的细胞核中。生理情况下，Ku70在DNA的损伤修复起重要作用，维持基因组的稳定性;而在肿瘤的发展过程中，DNA复制往往出现损害，Ku70表达有可能出现反应性增高，在肝癌组织中表达升高，而在癌旁和正常肝组织中表达量较低甚至是阴性。在临床病理指标检测中，通过单因素和非条件Logistic统计分析，明确Ku70蛋白的表达增高，与术前较差的肝功能、较大的肿瘤直径以及较高的TNM分期有关;而进一步的生存分析还表明，Ku70高表达的患者，其生存情况亦较差。至此初步明确Ku70蛋白的表达提示了HCC的恶性进展程度，与肝癌细胞的增殖可能有一定的相关性。

总之，本研究首次发现Ku70蛋白是HCC诊断的潜在肿瘤标志物，对接受手术治疗的HCC患者的预后判断有较好的应用价值，是一个具有良好潜在应用前景的分子标志物。

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