超临界流体技术构建壳聚糖纳米粒/PLLA-PEG-PLLA复合微粒及其表征

陈爱政，康永强，王士斌，唐娜，赵晖

（1 华侨大学化工学院，福建 厦门 361021；2 华侨大学生物材料与组织工程研究所，福建 厦门 361021）

引 言

核壳结构复合材料一般由核心与外壳通过物理或化学作用形成，其形式一般包括无机/有机、无机/无机[1]、有机/有机[2]以及核心为液体或无核心的微胶囊和微球。核壳结构复合材料不仅具有核心和外壳的性能，还因为核壳材料性质的相互补充而具有核壳单一材料所不具有的新性能[3]，已成为复合材料、纳米材料等领域的研究热点[4]。

在药物载体方面，核壳结构复合材料能够提高载药量和包封率、优化载体性能、利于包载蛋白质或基因和共载药物等[5]。本课题组在该方面进行了较多的探索和研究，Chen 等[6]建立了可用于制备核壳结构的SpEDS 技术，即将纳米粒悬浮在壳材的有机溶液中，喷入高压釜，与超临界二氧化碳相互作用，使得壳材在纳米粒表面析出，实验发现制得的载药核壳结构复合材料与非核壳结构载药载体相比载药量、包封率和缓释性能都得到了改善。近年来，核壳结构复合材料在共载药物中也得到了广泛应用。共载药物，特别是共载基因和药物，在癌症治疗领域中能够取得良好的联合治疗效果，有望成为治疗癌症方案中的最佳选择，因此备受关注。

目前应用于共载载体的复合材料主要基于无机物质、脂质、聚合物等[7]。无机物质方面，以二氧化硅的研究较多，但其具有一定的毒性[8]。脂质方面，以阳离子脂质体的研究较多[9]，但脂质体本身不易储存，而且应用于共载基因和药物时其内部载药、外部载基因的结构导致其血液稳定性差、网状内皮系统吸附、内涵体逃脱阻碍等问题，对基因的保护和防降解作用不够[10]。在基于聚合物方面，壳聚糖因具有免疫原性小、无毒、转染率高及方便修饰的特点，广泛应用于药物、DNA 和RNA[11]的运输。Xu 等[12]用精密造粒技术（PPF）制备了共载p53 与阿霉素（DOX）的壳聚糖纳米粒的双壁微球，在癌症治疗方面可能具有协同作用。Liu 等[13]制备了共载卡培他滨和球蛋白的壳聚糖/海藻酸盐微包纳体系，能够明显地控制药物的释放，而且所载药物具有顺序释放的性质。此外，聚乳酸（polylactic acid,PLLA）是一类生物可降解的医用高分子材料，具有良好的生物相容性、药物缓释效果和无免疫原性等特性，已通过美国FDA 认证，在医药领域中应用广泛[14]。其中聚乳酸衍生物PLLA-PEG-PLLA和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）具有双亲性，降解速率快，已广泛应用作为基因和药物载体[15-16]。

核壳结构复合材料的制备方法有乳液聚合、界面聚合、分散聚合、自组装和层层沉积等，或是几种方法的结合[17]，但总体上存在易于聚集、融合、分离和纯化产品困难等问题。一方面，除去载药载体中残留的溶剂和多余药物需要大量时间和成本，而且制备过程使用有机溶剂，易造成溶剂残留，会产生一定的毒性。另一方面，制备过程条件苛刻，所使用的温度较高或pH 变化较大，会导致药物失活，不适合用于多肽、蛋白质类大分子药物和其他热敏性物质[18-19]。离子凝胶法操作简单，不使用有机溶剂，条件温和，同时超临界流体（SCF）的临界点（CO2，PC=7.38 MPa,TC=304.1 K）易实现，溶解和扩散性能良好，使其拥有温和的制备条件，适用于热敏性物质的加工[20-21]，而且制得的载体有机溶剂残留量低，显示出良好的生物安全性[22]，成为药物剂型制备的热门方法[23-25]。

基于以上分析，本研究结合离子凝胶法和SCF技术各自的优点，采用SpEDS 技术制备具有核壳型结构的CS NPs/PLLA-PEG-PLLA 复合微粒。首先对CS NPs 的制备条件进行考察，其次对复合微粒的制备条件进行优化，最后对CS NPs 和复合微粒的理化性质和生物相容性进行研究，为复合微粒的载药药效考察和实际应用提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 材料与仪器

聚乳酸-聚乙二醇，50×103，济南岱罡生物工程有限公司；壳聚糖（200～400 mPa·s，脱乙酰度≥95%）、三聚磷酸钠（AR，纯度≥98%），阿拉丁；磷钨酸、氢氧化钠、乙酸、二氯甲烷（AR，纯度≥99.5%）、丙酮（AR，纯度≥98%）、溴化钾，国药集团；高糖DMEM 培养基、胎牛血清FBS，美国Gibico 公司；Alamar Blue，美国Invitrogen 公司；人体乳腺癌细胞Bcap-37，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；其余试剂均为进口或国产分析纯。

超临界造粒装置（同轴喷嘴内径100 μm、外径500 μm），南通华安超临界有限公司；扫描电子显微镜S-4800、透射电子显微镜H-7650，日本Hitachi公司；zeta 电位粒度仪ZetaPALS，英国马尔文仪器公司；傅里叶变换红外光谱仪FTIR 8400S，日本Shimadzu 公司；差示扫描量热仪DSC 200F3，德国Netzsch 公司；热重分析仪DTG-60H，日本岛津公司；多功能酶标仪SpectraMax M5，美国Molecular Devices 公司；pH 计HI8424C，北京哈纳科仪器科技有限公司；倒置显微镜IX51、数码相机C-5060，日本奥林巴斯光学工业株式会社。

1.2 壳聚糖纳米粒的制备

将定量的壳聚糖加到1%乙酸溶液中，充分搅拌溶解，将三聚磷酸钠加入纯化水中，搅拌溶解，分别0.22 μm 微滤后，得到壳聚糖溶液和三聚磷酸钠溶液。量取一定体积的壳聚糖溶液于试管中，置于涡旋仪上，缓慢加入三聚磷酸钠溶液，继续涡旋1 min，室温孵育30 min，即可得到CS NPs 溶液。

1.3 复合微粒的制备

SpEDS 过程如图1所示，称取一定量的PLLA-PEG-PLLA 溶于二氯甲烷中，然后加入一定体积的丙酮作为非溶剂，再加入一定体积的CS NPs溶液，得到不同非溶剂/溶剂比的混合溶液。钢瓶中的CO2经过制冷系统液化后，由高压柱塞泵进行加压，泵入结晶釜中，待釜内达到所要求的压力时（12 MPa），维持CO2泵入速率，开启放气阀，然后以一定速率放气（1500 L·h-1），并调节结晶釜外部干燥箱，保持釜内压力、温度的恒定。当达到实验所需温度（35℃）后，ScCO2通过结晶釜顶部的同轴喷嘴外侧通道，混合溶液由高压恒流泵通过喷嘴内侧通道，同时泵入结晶釜。结束泵样，维持 釜内的压力及温度不变，继续通入新鲜的CO2淋洗20 min。缓慢卸压，待釜内压力降为常压时，收集样品。

图1 超临界抗溶剂制备复合微粒的过程Fig.1 Schematic diagram for preparation of MPs by SpEDS

1.4 形貌观察

（1）粒度检测：量取一定体积的样品溶液，采用zeta 电位及纳米/亚微米粒度分析仪测量粒径和zeta 电位，置于测量杯中，放入仪器中，用DTS 5.00软件分析数据。

（2）场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察：样品在真空干燥箱中充分干燥，将其置于导电胶上，喷金3 min，置于FE-SEM 下，观察样品的表面形态。

（3）TEM 观察：配制一定浓度的样品混悬液，用移液枪吸取10 μl 混悬液滴在铜网上，静置5 min。用滤纸吸取多余的液体，再向铜网滴加2.0%、pH 7.0的磷钨酸负染10 min（仅CS NPs 进行负染），置于暗处充分干燥后，采用TEM 观察样品形貌。

1.5 理化表征

（1）傅里叶变换红外光谱分析（FTIR）：取适量KBr 在玛瑙研钵中研磨成细粉，然后压片至透明度较好时，将其作为空白样，扫描基线。另取适量KBr，研磨成微细粉末，加入样品，继续研磨，压片后在波数4000～400 cm-1范围内检测制备前后样品的特征官能团。

（2）差示扫描量热分析（DSC）：取10 mg 左右的样品，置于Al2O3坩埚中，温度范围20～200℃，升温速率10℃·min-1，载气氩气，气体流量20 μl·min-1。

（3）热重分析（TGA）：在N2流量为50 mg·ml-1的气氛下，设定压力为0.1～0.2 MPa，在20～800℃范围内以10℃·min-1的升温速率进行扫描。

1.6 载体细胞毒性的考察

（1）取对数生长期的Bcap-37 细胞，以每孔2×104个细胞的密度接种于96 孔培养板上，每孔100 μl，37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。

（2）待细胞的汇合度约80%时，弃去原液。向各受试组分别加入不同体积的CS NPs 溶液，补齐至每孔200 μl，考察CS NPs 的细胞毒性；向复合微粒组的各受试组分别加入培养基超声分散（200 W,10 min）的复合微粒溶液（250、500 和 1000 μg·ml-1），每孔200 μl，考察复合微粒的细胞毒性。其中，阴性对照组均加入新鲜培养基。

（3）于加样后不同时间点弃去孔板中的培养液，用PBS 缓冲液洗涤2 次，向每孔中加入含有10% Alamar Blue 的新鲜培养基100 μl，在培养箱中继续培养4 h。用酶标仪检测各孔的吸光度值（检测波长570 nm，参考波长600 nm）。通过式（1）计算细胞的相对增殖率（relative growth rate,RGR）

2 结果与讨论

2.1 CS NPs 形貌观察

经过条件摸索，确定制备CS NPs 的优化条件为壳聚糖浓度2 mg·ml-1、pH 5.0、三聚磷酸钠浓度1 mg·ml-1。从透射电镜图2（a）和扫描电镜图2（b）可以看出优化条件下制备得到的CS NPs 平均粒径为50～100 nm。该粒径与粒度分析仪所测结果相比，可以发现粒度分析仪测得的粒径是电镜测得的3～6 倍。这是因为CS 溶解在乙酸溶液中，与TPP 溶液发生作用后形成的CS NPs 处于膨胀的状态，而且具有较大的水化层。当电镜观察时，样品经过干燥，水分蒸发，发生了一定程度的皱缩，从而导致两种测试结果不一致。

杨心督等[26]对聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖自聚集的纳米球进行粒度表征时同样出现该现象，对此给出的解释是测试时样品的状态导致结果不一样。但是两种测试方法的粒径结果间只相差1 倍，小于本研究存在的差异。这有可能是聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖是一种两亲性分子，具有较小的水化层，而本研究的壳聚糖的亲水性较大，因此CS NPs具有较大的水化层，导致倍数相差更大。

2.2 复合微粒的制备优化

图2 壳聚糖纳米粒的形貌Fig.2 Morphology of CS NPs

2.2.1 全因子设计实验 本实验中确定的关键变量如下：油相浓度、水油比、溶液流速和溶剂/非溶剂比。首先，浓度对颗粒粒径的影响取决于抗溶剂过程中晶体生长时间和生长速度的平衡关系，浓度通 过影响溶液的过饱和度和黏度最终影响颗粒的粒径。其次，水油比影响溶液的稳定性和抗溶剂效果，而溶液流速的大小除了影响抗溶剂效果外还影响溶液在离开喷嘴后的雾化效果。最后，由于PLLA-PEG-PLLA 溶于二氯甲烷（dichloromethane,DCM）而不溶于丙酮（acetone），丙酮作为非溶剂能够增大溶液的过饱和度，从而影响颗粒的粒径。同时丙酮的加入有助于CS NPs 的分散，能够较好地形成包埋CS NPs 的复合微粒。通过Minitab 全因子实验设计软件，考察表1所列的4 个工艺参数对复合微粒形貌和粒度分布的影响，设计出24因子实验表（表1），并用zeta 电位及纳米/亚微米粒度分析仪测试各实验组样品的粒径和zeta 电位，结果见表2（每组重复两次）。并通过统计性分析确定各变量对复合微粒粒径和zeta 电位的显著性影响及趋势，进而通过验证实验得出复合微粒最佳的制备工艺。

从图3（a）平均粒径主效应图可以看出，复合微粒粒径随水油比和溶液流速增大而增大，随油相浓度增大而减小，但其斜率都较小，表明在所考察的范围内水油比、溶液流速和油相浓度对复合微粒最终粒径的影响不明显。从图3（b）平均粒径效应正态图可以看出，溶剂/非溶剂比远离直线，表明其为影响复合微粒粒径的显著的影响因素。在不改变其他条件的情况下减小溶剂/非溶剂比，可以增大溶液的过饱和度，使得PLLA-PEG-PLLA 析出更快，有利于形成包覆CS NPs 均一且较小的复合微粒。zeta 电位方面，从图3（c）、（d）可以看出，除了水油比外，其他3 个因素对复合微粒的zeta 电位均存在不同程度的影响，但均不显著。

表1 实验因子和实验水平Table 1 Experimental factors and levels

表2 超临界流体强制分散悬浮液过程制得复合微粒的平均粒径和zeta 电位Table 2 Mean size and zeta potential of MPs prepared by SpEDS

经过进一步的分析得到了平均粒径和zeta 电位的重叠等值线图（图4），从而预测平均粒径和zeta 电位符合一定要求（200～400 nm，-50～-30 mV）的复合微粒制备条件。考虑到水相对CS NPs 在有机溶剂中分散效果的影响、样品收集和载药药效的发挥，最终确定复合微粒制备的优化条件：油相浓度为 5 mg·ml-1、水油比为0.75:10.00、溶液流速为2 ml·min-1、溶剂/非溶剂比为0.5:1.0。

2.2.2 复合微粒的表面形态 从图5可以看出，实验所得的复合微粒表面光滑，多为球形。当溶剂/非溶剂比为0.5:1.0 时，即Run 2、4、7、10、12、13、14、17 的复合微粒平均粒径比其他组更小，说明溶剂/非溶剂比是超临界抗溶剂过程制备复合微粒的重要影响因素。

关于溶剂/非溶剂比在超临界抗溶剂造粒过程中的影响已有诸多文献报道[27-28]，对颗粒粒径的影响有两方面：一方面，高浓度使得溶液较快达到过饱和，晶体生长比晶核生成更占主导地位，而且高浓度也导致溶液黏度变大，二者共同作用使制得的颗粒粒径变大；另一方面，浓度高使溶液的过饱和度高，成核速率快，能够形成粒径较小的颗粒。基于以上两方面分析，非溶剂的使用能够很好地解决上述看似矛盾的现象。这是因为非溶剂的加入使溶液能够具有较低的浓度和较高的过饱和度，其中低浓度使颗粒形成过程中成核占主导地位，高过饱和度使该过程具有较快的成核速率，从而越有可能获 得球形度良好、平均粒径更小的纳米粒。本研究通过增加有机非溶剂丙酮来改变材料在溶液中的过饱和度，有机非溶剂所占的比例越大，溶液的过饱和度就越高，在SpEDS 过程中成核速率就越快，复合微粒的形成速度也越快，球形度更好，粒度更加均一。

图3 Minitab 分析结果Fig.3 Minitab analysis

图4 平均粒径和zeta 电位的等值线图Fig.4 Contour plot of mean sizes and zeta potential

2.3 优化组复合微粒的粒度及形貌表征

从图6可以看出CS NPs 的平均粒径为314 nm。优化组复合微粒的平均粒径为323.7 nm，符合Minitab 软件预测的结果，说明该全因子实验及其预测具有可信度。而超纯水相优化组（MPs without CS NPs）和无水相优化组（MPs without water phase）复合微粒的平均粒径分别为412.1 nm 和628.3 nm，说明在相同条件下水相和CS NPs 溶液相对制备得到的微粒粒径产生了不同的影响。CS NPs 溶液相使制得的复合微粒粒径变小，这与之前的研究结果一样[6,29]。这是因为CS NPs 的存在使得PLLA-PEG- PLLA 在一定程度上析出并附着在CS NPs 表面，而非形成独立的PLLA-PEG-PLLA 微粒。同时CS NPs 起晶核的作用，降低了PLLA-PEG- PLLA 析出的能垒，使其容易快速在CS NPs 表面析出，形成更小的微粒。从图7复合微粒透射电镜图可以看出，CS NPs 包埋在PLLA-PEG- PLLA 中，形成核壳型的复合微粒，经Nano Measurer 软件测量，该复合微粒的粒径比图6粒径测试的结果小，说明PLLA-PEG-PLLA 材料的亲水性导致复合微粒表面尚存在一定的水化层。

图5 不同制备条件下所得复合微粒的扫描电镜图Fig.5 SEM images of MPs obtained in different run orders

图6 优化组复合微粒的平均粒径Fig.6 Mean sizes of MPs under optimal condition

图7 优化组复合微粒的透射电镜图Fig.7 TEM image of MPs under optimal condition

2.4 FTIR 表征

图8 壳聚糖纳米粒和复合微粒的红外光谱图Fig.8 FTIR spectra of CS NPs and MPs

从CS 原材料、TPP 原材料和CS NPs 的红外光谱[图8（a）]可以看出：原料CS 方面，3429 cm-1为—OH 的伸缩振动吸收峰，1651 cm-1和1601 cm-1分别为酰胺键和—NH2的吸收峰，1084 cm-1为C—O—C 的伸缩振动吸收峰；TPP 方面，1096 cm-1和903 cm-1分别是TPP 的P—O 键伸缩振动吸收峰和弯曲振动吸收峰，1215 cm-1处为伸缩吸收峰；CS NPs 方面，吸收峰有一定右移，可能是 因为TPP 与CS 静电结合后影响CS 分子的电荷密度，导致其官能团吸收峰发生一定程度的蓝移现象，具体如—OH 的伸缩振动吸收峰迁移至3421 cm-1、1651 cm-1和1601 cm-1分别迁移至1634 cm-1和1539 cm-1，同时CS NPs 中1078 cm-1和893 cm-1分别出现TPP 的P—O 键伸缩振动吸收峰和弯曲振动吸收峰以及在1215 cm-1处有伸缩吸收峰。上述官能团吸收峰的变化情况与文献报道[30-31]一致。由此可推测，TPP 的磷酸根与CS 的氨基位点作用，形成了CS NPs。如红外图谱图8（b）所示，在优化组复合微粒中1634 cm-1和1215 cm-1均有各自的吸收峰，应为CS NPs 中所含有的特征吸收峰，表明 CS NPs 存在复合微粒中。另外，PLLA-PEG-PLLA 原料和复合微粒均在1759 cm-1处找到特征吸收峰且无新的特征峰出现，表明该超临界抗溶剂过程是一个物理过程，不涉及化学变化。这与Chen 等[32]的研究结果一致，说明超临界流体过程只是改变物质的物理状态，不引起官能团的明显变化，适合应用于药物载体的制备。

2.5 TGA 表征

图9 壳聚糖纳米粒和复合微粒的热重曲线Fig.9 TGA curves of CS NPs and MPs

如热重曲线图9（a）所示，100℃之前原料CS 和CS NPs 都有一定的质量损失（15%～20%），是由于样品中残留的水分引起的。CS NPs 的分解温度在230℃附近，而原料CS 的分解温度开始于250℃，并在450℃附近质量急剧下降，该结果与李国明等[33]的研究类似。其中CS 和TPP 通过静电结合后氢键受到破坏，是其分解温度有所降低的重要原因。一方面，CS 的氨基与TPP 的磷酸根通过静电结合，氢键减少；另一方面，CS NPs 形成过程中部分基团以氢键的形式与水结合，使得CS 分子中以氢键连接的连接点减少，这也从另一方面说明了CS NPs的形成。如图9（b）所示，从CS NPs 和优化组复合微粒的热重图可以看出，100℃之前CS NPs 有质量损失，是由于CS NPs 中水分蒸发所致。CS NPs从225℃开始出现了质量的急剧损失，是由于CS NPs 在此温度后开始分解所致。复合微粒从179℃起质量急剧下降，而原料PLLA-PEG-PLLA 的分解温度为266℃。二者分解温度的差异，可能是因为优化组复合微粒所包裹的CS NPs 中的水分蒸发，同时也引发经超临界处理后的CS NPs 提前开始分解。此外，超纯水相复合微粒的分解温度为307℃，高于原料PLLA-PEG-PLLA 的分解温度，说明经过SpEDS 过程后材料PLLA-PEG-PLLA 的热稳定性能有所提高，同时也证实优化组复合微粒分解温度为179℃是由于其含有CS NPs 造成的。在800℃之前优化组复合微粒所剩下的质量分数比超纯水相复合微粒多，说明优化组复合微粒中含有CS NPs，这一点可由优化组复合微粒的透射电镜图得到验证。

2.6 DSC 表征

如差热曲线图10（a）所示，CS NPs 和原料CS 均在60～70℃之间有较宽的吸热峰，峰值分别为65.6℃和69.1℃，这是水分蒸发吸热所致。此外，CS NPs 和原料CS 分别在271.4℃和大于300℃的位置出现了放热峰，表明物质开始分解。

图10 壳聚糖纳米粒和复合微粒的差热曲线Fig.10 DSC curves of CS NPs and MPs

图11 Alamar Blue 法测定壳聚糖纳米粒及其复合微粒的细胞毒性Fig.11 Cytotoxicity of CS NPs and MPs evaluated by Alamar Blue assay

李国明等[33]报道制备了载药壳聚糖微球，其中DSC 结果显示原料CS 的分解温度为310℃，而形成的空白壳聚糖微球分解温度提前至260℃，与本研究的DSC 结果一致，说明CS 和TPP 通过静电结合后，由于氢键被破坏，其分解温度有所降低，故CS NPs 的分解吸热峰比原料CS 提前。如图10（b）所示，原料PLLA-PEG-PLLA 的两个熔融吸热峰分别是170.6℃和177.4℃，说明在材料中存在两种不同结晶区[34]，而复合微粒在此处只存在170.6℃单一吸热峰，说明经过ScCO2抗溶剂处理后材料的高温结晶区消失或向低温结晶区转变，晶型更加均匀。此外，优化组复合微粒中131.6℃和170.6℃分别代表所含CS NPs 中的水分蒸发的吸热峰以及复合微粒的熔融吸热峰。与CS NPs 相比，复合微粒中的CS NPs 水分蒸发的吸热峰从 65.6 ℃移动到131.6℃，有可能是因为PLLA-PEG-PLLA 材料对CS NPs 有一定的包封作用并形成核壳型复合微粒，产生了热传递阻碍作用，导致水分的蒸发过程需要更高的温度才能进行。张艳辉等[35]在研究乙二醇双硬脂酸酯/PMMA 核壳储能微胶囊时也发现经包埋后微胶囊的熔点峰变大，说明壳材对核材的传热有阻隔作用，从而出现滞后的现象。然而，Kang 等[36]制备包载牛血清蛋白的聚乳酸微粒时发现经包载后的牛血清蛋白的熔融峰变小，这是因为熔融峰的变小与牛血清蛋白的浓度低以及自身的螺旋折叠结构有关。因此，熔融峰的改变与载体材料性质和载体结构都有一定的关系。

2.7 载体的细胞毒性

从图11得知，各个加样量的实验组的细胞相对增殖率均在100%附近。通过分级标准表3可知，CS NPs 和复合微粒的细胞毒性处于0 级，安全系数高。该结果说明实验中制备得到的CS NPs和复合微粒的生物相容性好。Chen 等[22]将PLLA-PEG-PLLA 用于包埋具有一定毒性的四氧化三铁纳米粒，能够明显降低细胞毒性，说明PLLA-PEG-PLLA 的生物相容性好。本研究中CS也是生物相容性好的高分子材料，导致CS NPs和复合微粒的生物相容性无明显差别，也说明本研究所采用的离子凝胶法和超临界抗溶剂过程是绿色环保的载体制备方法，所制得的载体生物相容性良好。

表3 细胞相对增殖率分级标准Table 3 Criterion of cell relative growth rate gradation

3 结 论

本研究利用离子凝胶法和超临界强制分散悬浮液技术分别制得CS NPs 与CS NPs/PLLA-PEG- PLLA 复合微粒，进行了制备条件的考察和优化、理化性质表征和生物相容性研究等一系列实验。结果表明：① 优化条件下制得的CS NPs，其表面较光滑，球形度好，粒径分布窄；② 超临界强制分散悬浮液技术过程中，溶剂/非溶剂对复合微粒的粒径具有显著影响，优化后的复合微粒具有一定的核壳型结构，而且其官能团未发生明显的变化，但材料的物理形态发生了一定的改变；③ CS NPs 及其复合微粒无明显细胞毒性，具有良好的生物相容性。

以上结果，将有利于核壳结构的复合微粒进一步应用于共载基因和药物的药效研究中，有望在癌症治疗领域取得良好的联合治疗效果。

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