强心胶囊对心衰大鼠血流动力学及MAPK信号通路的影响

李晓 童晓云 倪凯 杨建红 侯肖霖 胡孝刚

摘要：目的探讨强心胶囊对心力衰竭大鼠心脏血流动力学及丝裂原活化蛋白激酶（ MAPK）信号通路的影响。方法采用盐酸阿霉素腹腔注射法制作心衰大鼠模型，造模成功后的50只大鼠随机分为模型对照组、卡托普利组、强心胶囊低、中、高剂量组 另设正常对照组10只。分别给予生理盐水20mL/kg、卡托普利组100mg/kg、强心胶囊0.2g/kg、强心胶囊0.4g/kg、强心胶囊0.8 g/kg、生理盐水20mL/kg灌胃给药4周，4周后观察心衰大鼠血流动力学改变，Westem印迹法观察心衰大鼠心肌ERK、P38、JNK的表达情况。结果强心胶囊低、中、高剂量组均可改善心衰大鼠的血液动力学（P<0.05），且对心衰大鼠心率无明显影响，其中强心胶囊高剂量组效果与卡托普利组相仿；与模型对照组比较，强心胶囊中、高剂量组ERK、P38、JNK的蛋白表达水平均不同程度降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论中、高剂量强心胶囊可改善心衰大鼠血流动力学指标，可能与其通过下调MAPK通路ERK、P38、JNK蛋白的表达有关。

关键词：强心胶囊；心力衰竭；MAPK通路

中图分类号：R285

文献标志码：A

文章编号：1007 - 2349（ 2015） 01 - 0062 - 03慢性心力衰竭（ Chronic Heart Failure，CHF）的发生与神经内分泌系统的过度激活有关，神经内分泌系统主要是通过信号传导途径，长期、慢性激活促进心肌重塑，最终导致CHF的发生。CHF的发生、发展起重要作用的是细胞凋亡，丝裂原活化蛋白激酶（ Mitogen activated protein kinase.MAPK）是调控细胞增长与凋亡过程的重要信号转导途径，主要包括细胞外信号调节激酶（ ERK）、P38蛋白激酶、c-jun N末端激酶（JNK）等亚型[1]。强心胶囊由生黄芪、制附子、生晒参、泽泻、血竭等13味中药组成，其功效为益气活血，温阳利水，临床用于治疗心力衰竭已10余年，取得了较好的临床疗效。本研究以强心胶囊干预心力衰竭大鼠，观察心衰大鼠血流动力学改变，用Western印迹法进行MAPK信号通路相关ERK、P38、JNK蛋白表达的检测，进一步探讨强心胶囊治疗CHF可能的作用靶点，现报道如下。1 材料与仪器1.1 实验动物成年清洁级雄性SD大鼠100只，体重180 -220g，购白昆明医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（昆）2011 - 0004，常规条件饲养，保持室温23 - 25℃，湿度30% -70%。1.2实验药物与试剂 强心胶囊：生黄芪、制附子、生晒参、桂枝、血竭等13味中药组成，0. 4g/粒，由云南省中医医院制剂中心制作，批号20130429；注射用盐酸阿霉素，lOmg/支，浙汀海正药业股份有限公司生产，批号130703；卡托普利：25 mg/片，北京亚宝生物药业有限公司生产，批号12080031；BS368（ bioworld）； ab31828（ abcam）， BS1544（ bioworld）； Ab75744（ ab-cam）；30%丙烯酰胺；ddH20；SDS（ Amresco）；TEMED（ Sigma）等。1.3实验主要仪器与材料 电子天平为Sartorius公司（德国）产品，微量加样器为Cilson公司（法国）产品，微量加样吸头为北京鼎同牛物有限公司产品，电热恒温水浴槽为上海医用恒温设备厂产品，- 80℃低温冰箱为SANYO（日本）产品，制冰机为AF10 SCOTSMAN（美国）产品，PVDF膜（孔径为0. 22μm）为Millipore公司产品，医用X射线胶片为柯达公司产品，通用显影粉、酸性定影粉为天津亨达公司感光材料厂产品，高速离心机为上海医用分析仪器厂产品，转移脱色摇床为海门其林贝尔仪器制造公司产品，旋涡混匀器为海门麒麟医用仪器厂产品，电泳仪为北京百晶生物技术有限公司产品，低温离心机为德国Sigma公司产品，凝胶玻璃板、固定夹、垂直电泳槽、转移电泳槽为美国BIO - Rad公司产品，美国UVP凝胶成像系统，为thermo公司产品，型号：CA91786 USA UVPGDS - 8000 System。半干转膜仪系统为ATTO公司产品，型号：WSF - 4040。2实验方法2.1 动物模型复制、分组、给药100只成年SD雄性大鼠，随机抽取10只为正常对照组，余90只采用腹腔注射盐酸阿霉素法复制心衰大鼠模型21，按第1次和第2次1. 0mg/kg.d剂最；第3次和第4次2. 0mg/kg.d剂量；第5次和第6次1.0mg/kg.（1剂量；第7次和第8次2.Omg/kg.d剂量；累积剂量12mg/kg，隔天注射，共计15d，观察大鼠表征及行为改变。l5大后行心脏彩超检查，以左室射血分数（ LVEF）值低于45%作为心衰模型成功的标志，同时大鼠出现体重减轻、精神萎靡、毛色无光泽，列入观察对象。筛选存活且造模成功的50只夫鼠按随机分为5个组：M组为模型对照组（生理盐水20mL/kg）；K组为卡托普利组（100mg/kg溶于生理盐水）；D组为强心胶囊低剂量组（0. 2g/kg，相当于人的临床剂量的2.5倍）；Z组为强心胶囊中剂量组（0. 4g/kg，相当于人的临床剂量5倍）；G组为强心胶囊高剂量组（0.8 g/kg，相当于人的临床剂量的10倍）。Y组为正常对照组（生理盐水20mL/kg），连续灌胃给药4周，观察整个实验过程中大鼠一般情况。2.2 血流动力学指标测定各组灌喂不同药物4周后，于末次给药后6h，以25%乌拉坦按SmL/kg腹腔注射麻醉大鼠后，仰卧固定分离右侧颈总动脉，由颈总动脉插管至左心室，连接八导生理记录仪，记录动脉收缩压（ SBP）、动脉舒张压（ DBP）、心率（HR）、平均动脉压（MAP）、左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（ LVEDP）、左室内压最大收缩率（+dp/dtmax）、左室内压最大舒张压（- dp/dtmax）。2.3

Westem印迹法检测ERKI/2、p38和JNK蛋白表达2.3.1 心肌采集，蛋白提取各组于灌喂不同药物4周后各取3只大鼠，腹腔注射麻醉处死大鼠，仰卧固定四肢，取出心脏，冰生理盐水冲洗，滤纸吸干称重，匀浆，心肌组织蛋白提取，- 80℃保存备用。2.3.2制备SDS - PAGE凝胶，组装电泳槽将灌胶玻璃板洗净，晾干固定，配制10%分离胶8 mL快速灌入凝胶玻璃槽中；立即用去离子水覆盖胶面，室温放置约40 min至分离胶凝固；配制5%浓缩胶4 mL；倒掉去离子水覆盖液，并用吸水纸吸掉残留的液体；将凝胶板重新垂直放置，轻轻加入5%浓缩胶液，插入样品梳，室温凝胶约40 min。轻轻拔去梳子，将玻璃夹板“凹”面贴紧电泳槽，固定在电泳槽上。2.3.3样品变性及电泳、凝胶转膜及曝光、洗片、扫描由一80℃冰箱取出提取的组织总蛋白样品，根据蛋白定量结果，加入相应体积的总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液混合，95℃变性10 min，将电压调至80V，使样品通过浓缩胶与分离胶（电压约8v/cm）。电泳使染料至分离胶适当位置，结束电泳。凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至PVDF膜上，然后分别用非标记·抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育，洗膜，曝光洗片.，采用美国UVP分析仪器，对胶片进行扫描，然后括住每·个条带，系统自动生成灰度值，即为结果。2.4统计学处理计量资料以均数±标准差表示，多样本均数比较用one - way ANOVA法，数据先进行方差齐性的Levene检验，方差齐时用组间比较的LSD法，符合正态分布但方差不齐时用Tamhane's T2检验。3实验结果3.1 各组大鼠血流动力学情况各组大鼠血流动力学情况见表1。由表l可见，模型对照组血压（ SBP、DBP、MAP）与正常对照组及各治疗组比较均有显著性差异（P<0.05），强心胶囊低、中、高剂量组Im压与剂量呈正相关，强心胶囊高剂量组与卡托普利组之间差异无显著统计学意义，提示强心胶囊高剂量组与卡托普利组效果相仿；各组间心率差异无显著统计学意义；与空白对照组的左室收缩压、左室舒张末压、左窀内压最大收缩率、左室内压最大舒张率相比，模型对照组及各治疗组均存在显著性差异；强心胶囊低、中、高剂量组左室舒张末压与剂量呈负相关，左室收缩压、左室内压最大收缩率及左室内压最大舒张率与剂量呈正相关；与卡托普利组相比，强心胶囊高剂量组左室收缩压、左室舒张末压、左室内压最大收缩率及左室内压最大舒张率之间差异无显著统计学意义。3.2 各组大鼠心肌ERK、P38、JNK蛋白表达水平 Westem印迹法检测结果显示，与模型对照组比较，强心胶囊中、高剂量组的ERK、P38、JNK的蛋白表达水平均不同程度降低，差异具有统计学意义，见表2。4讨论

慢性心力衰竭属祖国医学中“心悸”、“胸痹”、“喘证”、“怔忡”、“水肿”、“痰饮”等范畴。祖国医学认为，心衰为本虚标实之证，本虚以气虚为基础，甚则气损及阳，血脉瘀滞为中心病理环节，瘀血、痰浊、水饮是其标实之候。强心胶囊即是以为治则研制的纯中药制剂，强心胶囊由生黄芪、制附子、生晒参、桂枝、血竭、葶苈子、车前子等13昧中药组成，治以益气温阳、活血利水，方中黄芪、附片为主药，以益气温阳；生晒参、桂枝为臣药，以助主药益心气，通心阳，推动血液运行；血竭等活血化瘀；葶苈子、车前子化痰利水消肿，诸药合用，祛邪而不伤正。据现代药理研究证实，上述药物有增强心肌收缩力、利尿、扩血管、降低血黏度等作用，临床治疗CHF疗效确切。

MAPK是脊椎动物体内广泛存在的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，属于细胞外信号调节激酶，是细胞应激和损伤反应的主要信号通路，在缺血、缺氧、牵张、激素、生长因子和细胞因子等各种细胞外刺激.可诱导基因表达、细胞增殖等核反应，因此，有细胞质和细胞核联系的枢纽之称。它可将胞外刺激信号传递给胞核，与细胞连接以及内皮通透性等有密切关系。近年来，MAPK通路研究表明[3-4]，MAPK信号传导通路在心肌细胞肥大的启动以及心肌细胞肥大从代偿状态进入心衰的转换中起重要作用，活化的MAPK转位人核后引起转录因子磷酸化，提高应激蛋白基因转录水平，合成相关蛋白质，从而发挥心肌保护作用。目前，已在哺乳动物细胞克隆和鉴定出4条MAPK通路，即细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular sig-nal regulated protein kinase.ERKl/2）通路、c- Jun氨基末端激酶（c- Jun amino - terminal kinase，JNK/SAPK）通路、p38通路和ERK5通路[5]。这些激酶的信号通路具有高度保守性，即都由3个关键酶经过级联信号将胞外刺激传递到胞核，通过磷酸化因子调节细胞功能[6-7]。在MAPK通路的复杂调节网络中，ERK、JNK、p38MAPK是具有代表性的三个亚类。在应用药物干预过程中，通过检测上述通路蛋白的相关表达，可揭示干预药物的部分作用机理。

本研究结果显示，强心胶囊低、中、高剂量组均可改善心衰大鼠的血液动力学，且对心衰大鼠心率无明显影响，其中强心胶囊高剂量组效果与卡托普利组相仿。强心胶囊中、高剂量组ERK、P38、JNK的蛋白表达水平较模型组均有不同程度降低，差异具有统计学意义，但低剂量组的差异无统计学意义。低剂量组出现上述情况可能与中药的多成分性有关，影响了药物与受体的亲和力和内在活性，使蛋白的表达不明显。综上所述，本实验发现强心胶囊可改善心衰大鼠的血液动力学情况，并通过对心衰大鼠MAPK信号通路相关ERK、P38、JNK蛋白表达的检测，表明强心胶囊可能是通过ERK通路进行应激介导，调节心肌肥大相关的基因转录，促使相关心肌细胞凋亡，清除受损的心肌细胞；可能通过JNK通路抑制血管紧张素Ⅱ、内皮素以及儿茶酚胺的激活；并可能通过p38MAPK促进白细胞的聚集和活化，调节转录因子的活性及细胞因子的合成，从而控制炎症反应、改善心衰。通过本研究，初步揭示了强心胶囊改善心衰大鼠血液动力学的部分机理，为临床治疗CHF提供了一定的实验依据。参考文献：[1] Downward J The ins and outs of signaling[J]. Nature， 2001，411（ 6839）：759.[2]李梅秀，田国忠，欧叶涛，等大鼠阿霉素慢性心衰模型的制备与心衰指标的判定[J].解剖学研究，2005，27（3）：176-178.[3] Ravingerova T，Barancik M，Strniskova M. Mitogen-activated protein kinases：a new therapeutic target in cardiac pathology. Mol Cell Bio-Chem ，2003 ，247（1 -2）：127 - 138.[4] Sugden P H.Signalling pathways in cardiac myocyte hypertrophy. AnnMed，2001 ，33（9）：611 - 622.[5] Wang X，Tournier C.Regulation of cellular functions by the ERK5 siglalling pathey.Cell Signal，2006； 18（6）：753 - 760.[6]姜勇，RJ Ulevitch.LPS介导细胞激活的信号转导：从CD14到p38MAPK通路的研究，生理科学进展，1999，30（1）：29 -34.[7]Lee M，Choi L，Park K. Activation of stress signaling molecules in bat brain during aroused from hibernation. J - Neurochem，2002，82（4）：867 - 873（收稿日期：2014 - 11 - 10）