超高效液相串联质谱法分析猪肉中残留的15种β—受体激动剂

欧贝丽++倪伟华++邹+燕++赵佳丽

摘要 [目的]应用超高效液相色谱串联质谱技术建立同时测定猪肉中15种β-受体激动剂的检测方法。[方法]样品经β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解、0.2mol/L乙酸铵溶液（乙酸调pH至5.0）提取，阳离子固相萃取柱净化，以0.01mol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）-甲醇为流动相梯度洗脱，C18柱为色谱柱进行分离，串联质谱多反应检测（MRM）模式测定。[结果]15种β-受体激动剂在5～100 ng/mL 浓度范围内线性关系良好，3种添加水平下样品平均回收率在74.2%～115.6%之间。[结论]该方法提取效率高，净化效果好，具有良好的灵敏度和准确性，适合大批量猪肉样品中15种β-受体激动剂的快速测定。

关键词 超高效液相色谱-串联质谱；猪肉；β-受体激动剂；固相萃取

中图分类号 TS251.5+1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）12-0276-03

Determination of 15 β-agonists Residues in Pork by Ultra-performance Liquid Chromatography-mass Spectrometry

OU Bei-li NI Wei-hua ZOU Yan ZHAO Jia-li

（Jiaxing Institute for Food and Drug Control in Zhejiang Province，Jiaxing Zhejiang 314000）

Abstract [Objective]To develop a method for determination of 15β-agonists residues in pork by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry.[Method]The samples were enzyme hydrolyzed by β-Glucuronidase/aryl sulfatase，etracted with 0.2 mol/L Acetic acid-ammonium acetate buffering solution（pH=5.0），and cleaned up on a SPE cartridge，separated on a C18 column using 0.01mol/L ammonium acetate（contain 0.1% Formic Acid）- Methanol as mobile phase，and detected under multiple reaction monitoring（MRM）mode.[Results]The resultes displayed a good linearity for 15β-agonists over the range of 5～100 ng/mL.The mean recoveries were from 74.2% to 115.6% at three different concentrations.[Conclusion]The method was precise，sensitive，and highly efficient in extraction and purification，and it is suitable for fast analysis of β-agonists residues in a large number of pork samples.

Key words ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry；pork；β-agonists；solid phase extraction

β-受体激动剂，俗称“瘦肉精”，是一类化学合成的结构和功能类似于肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物，用于治疗支气管哮喘、平滑肌痉挛等疾病[1]。人们在研究过程中发现，其具有促进肌肉组织生长、减少脂肪沉积的作用，一些养殖户为追求更大经济效益在饲料中添加β-受体激动剂，以改善猪肉品质。但是由于这类药物在饲料中的添加剂量较大，易在肉中残留，人一次摄入一定量的高残留的猪肉即可出现β-受体激动剂的毒副作用[2]，近年来食用β-受体激动剂残留超标的肉类导致的中毒事件时有发生[3]。因此，该类食品安全问题已越来越受政府部门的重视，针对β-受体激动剂残留的初筛和确证方法研究已成为近年来兽药残留研究的热点[4-5]。本研究考察了15种常见的β-受体激动剂的提取净化条件，最终建立了同时测定猪肉中15种β-受体激动剂的UPLC-MS/MS方法。该方法快速准确，适合大批量猪肉样品中15种β-受体激动剂的快速测定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器。美国Waters公司 Acquity UPLC型超高效液相色谱、Quattro Premiere XE型三重四极杆串联质谱、电喷雾离子化源（ESI）、MassLynx4.0数据处理系统、单道可调移液器（10～100 μL、100～1 000 μL、1 000～5 000 μL德国Eppendorf公司）、Milli-Q Academic纯水系统（美国Millipore公司）、BP211D电子天平（德国Sartorius）KQ-500E型超声提取仪（上海仪器有限公司）、F6/10超细匀浆器（上海弗鲁克科技发展有限公司）、Mediwax固相萃取真空多联器（美国艾杰尔科技有限公司）、多功能氮吹仪（北京同泰联科技发展有限公司）、3-18K高速冷冻离心机（德国SIGMA公司）。

1.1.2 药品与试剂。盐酸克伦特罗、盐酸妥洛特罗、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林对照品均购自中国药品生物制品检定所，β-盐酸葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶购于美国sigma公司，溴代克伦特罗、马布特罗、溴布特罗、西布特罗、氯丙那林、马贲特罗、苯氧丙酚胺购于德国WITEGA Laboratorien Berlin，奥西那林、非诺特罗、克莱多巴胺、福莫特罗购于Dr.Ehrenstorfer（Augsburg，德国）。流动相所用甲醇、乙腈均为色谱纯（德国，Merck公司），甲酸（纯度为96%，TEDIA），乙酸铵（色谱纯，TEDIA），试验用水均为Millipore超纯水器制备超纯水。endprint

1.1.3 样品。空白猪肉为经检验不含β-受体激动的肉，10批猪肉样品，5批购自嘉兴市各大超市，5批购自嘉兴市农贸市场。将新鲜的空白猪肉和10批市售猪肉样品绞碎并均质，于-18 ℃冰箱避光保存，临用前于4 ℃冰箱解冻。

1.2 试验方法

1.2.1 空白基质溶液的配制。称取均质后的空白猪肉5.0 g于50 mL离心管中，加入约15 mL的0.2 mol/L乙酸铵-乙酸溶液（pH=5.0），涡旋混匀，超声提取10 min，4 ℃条件下8 000 r/min离心5 min，上清液转移至分液漏斗中，在提取液中加入正己烷，涡旋2 min，弃去正己烷层，保留提取液，作为空白基质提取液。

1.2.2 混合对照品溶液的制备。精确称取盐酸克伦特罗、盐酸妥洛特罗、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、溴代克伦特罗、马布特罗、溴布特罗、西布特罗、氯丙那林、马贲特罗、苯氧丙酚胺、奥西那林、非诺特罗、克莱多巴胺、福莫特罗对照品各10.00 mg，于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成1 mg/mL对照品储备溶液。分别吸取适量的各β-受体激动剂类药物的对照品储备液于刻度容量瓶中，用空白基质提取液稀释并定容，配成质量浓度分别为5、10、20、40、80、100 ng/mL的混合对照品溶液，用于制作标准曲线。

1.2.3 样品前处理。称取均质试样5.0 g于50 mL离心管中，加入约15 mL的0.2 mol/L乙酸铵-乙酸溶液（pH=5.0），再加入12 000 U的β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，涡旋混合10 min，于37 ℃水浴避光酶解6 h，每隔1 h，漩涡混匀1次。酶解完后于4 ℃条件下8 000 r/min离心5 min，上清液转移至鸡心瓶内，在提取液中加入正己烷，涡旋2 min，弃去正己烷层，残渣用10 mL的0.2 mol/L乙酸铵-乙酸溶液（pH=5.0）重复提取1次，再次加入正己烷脱脂，合并提取液，在37 ℃水浴中减压旋转蒸发至约2 mL，转移至一干净试管，用少量的0.2 mol/L乙酸铵-乙酸溶液（pH=5.0）洗涤鸡心瓶2次，合并洗涤液于同一试管，待净化浓缩。

Waters Oasis MCX柱依次用5 mL甲醇、5 mL水、2 mL 2%甲酸活化平衡，将上述提取液以0.25 mL/min的速度通过固相萃取柱，经3 mL的0.2 mol/L乙酸铵-乙酸溶液（pH=5.0）、3 mL的甲醇淋洗，弃去淋洗液，再用3 mL 5%氨水甲醇洗脱，重复洗脱1次，将洗脱液用氮吹仪于45 ℃浓缩至近干，用1.00 mL初始流动相溶解残渣，经0.22 μm微孔滤膜滤过，供UPLC-MS/MS分析。

1.2.4 UPLC条件。色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column（2.1×100 mm，1.7 μm），流动相系统：A为甲醇溶液，B为10 mmol/L乙酸铵（0.1%甲酸）水溶液，梯度洗脱（0～1 min，维持15%A；1～3 min，15%A线性变化至20%A；3～4 min，20%A线性变化至40%A；4～7 min，维持40%A；7～8 min，40% A线性变化至60%A；8～9 min，60%A线性变化至100%A；9～10 min，100%A线性变化至15%A）。流速为0.2 mL/min，柱温为40 ℃，进样量为5 μL。15种化合物的色谱分离情况见各MRM通道的叠加总离子流图（图1）。

1.2.5 质谱条件。离子源：ESI+；毛细管电压（kV）：3.00；离子源温度：120 ℃；RF透镜电压：0V；脱溶剂温度：350 ℃；脱溶剂气体流量：650 L/Hr；锥孔反吹气流量：50 L/Hr；质量分析器：低端分辨率1（V）：13.0 V；高端分辨率1（V）：13.0 V；离子能量1（eV）：1.0；低端分辨率2（V）：13.0 V；高端分辨率2（V）：13.0 V；离子能量2（eV）：1.0。各种药物的质谱采集参数见表1。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

β-受体激动剂在动物体内吸收后，经过代谢后大多数会与硫酸酯蛋白和葡萄糖醛酸作用，以硫酸轭何物和葡萄糖醛酸轭合物等结合态形式存在，因此需要将其转化为游离态进行检测。β- 受体激动剂类药物具有含氮碱性中心，在弱酸环境中能离子化，虽然β-盐酸葡萄糖醛苷酶宜在pH 值7左右的环境中酶解，但是为了保证β-受体激动剂被提取出来游离在提取液中，因此选择弱酸性的0.2 mol/L乙酸铵-乙酸溶液（pH=5.0）作为提取液。

2.2 色谱条件的优化

根据文献[6]，大多β-受体激动剂类的色谱分离采用由0.1%甲酸溶液和甲醇或乙腈组成的混合溶液作为流动相，试验比较了0.1%甲酸乙腈体系与0.1%甲酸-甲醇体系作为流动相时的情况，结果发现0.1%甲酸乙腈体系作为流动相时，沙丁胺醇、西布特罗、特布他林和奥西那林各通道之间有干扰（图2），这些化合物在色谱柱上的保留不理想，化合物之间有相互转化现象；在同样梯度及色谱柱条件下，在流动相水相中加入少量乙酸铵（10 mmol/L），待测物得到有效分离，各通道之间无干扰，保证测定灵敏度的同时，化合物之间的分离度也得到进一步改善。

同时比较了Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column（2.1×100 mm，1.7 μm）和 Waters ACQUITY UPLC CSH C18 Column（2.1×100mm，1.7 μm）2种色谱柱对该类化合物的分离效果。结果表明，虽然BEH柱上的个别化合物的响应不如CSH柱上的响应高，但对15种化合物整体分离效果BEH更好些，因此选用BEH C18柱。

2.3 方法学考察

考察了标准曲线及相关系数、精密度、回收率和定量限。“1.2.2”项下配制的各浓度的混合对照品溶液，按“1.2.4”和“1.2.5”项条件进行分析，测得15个β-受体激动剂的峰面积，依据峰面积与浓度的关系绘制标准曲线，并计算获得线性关系（表2）。可以看出，9种β-受体激动剂在5～100 ng/mL的 浓度范围内均有良好的线性关系。用空白基质配制浓度均为50 ng/mL的混合标准溶液，考察日内精密度和日间精密度，日内精密度由7次重复测定得到，日间精密度由连续5 d重复取样测定得到，结果样品的日内精密度RSD均小于10%，日间精密度RSD均小于15%，均在可接受范围内。在空白样品中分别加入10、40、80 ng/mL混合标准溶液，涡旋混匀后，按“1.2.3”方法进行提取净化，按“1.2.4”“1.2.5”条件测定回收率，结果见表2。采用标准溶液，空白基质提取液稀释的方法，以S/N≥3时目标物的含量为该方法的检出限，以S/N≥10时目标物的含量为该方法的定量限。经计算本方法测定15种β-受体激动剂的检出限为0.01～0.12 μg/kg，定量限为0.05～0.38 μg/kg。endprint

2.4 样品本底干扰的消除

由于猪肉基质复杂，对离子化有很强的促进或者抑制作用，为了消除样品基质效应，以空白样品提取液作为标准溶液的稀释溶液，可以使标准品和样品溶液具有同样的离子化本底，从而消除了样品的基质效应，使得该方法更加准确。

3 结论

10份样品中5份检出不同浓度的克伦特罗，1份检出沙丁胺醇。其中，检出克伦特罗的5份样品有4份来自农贸市场，检出沙丁胺春的样品也购自农贸市场。农贸市场个体户处购买的样品，无论检出概率和检出量均大于大型超市购买的盖有检验检疫印章的样品。

本方法建立了同时测定猪肉中15种β-受体激动剂残留的超高效液相质谱联用检测方法。前处理过程中应用酶解方法进行提取，再经过混合阳离子交换柱进行净化。该方法提取效率高，净化效果好，具有良好的灵敏度和准确性，适合大批量猪肉样品中15种β-受体激动剂的快速测定。

4 参考文献

[1] SHELLEY R，SALPETER M D，NICHOLAS S，et a1.Meta-analysis：effect of long-actingβ-agonists on severe asthma exacerbations and asthma-related deaths [J].Annals of Internal Medicine，2006，144（12）：904-912.

[2] KOEBERL DD，LI ST，DAI J，et al.β2-Agonists enhance the efficacy of simultaneous enzyme replacement therapy in murine pompe disease [J].Mol Genet Metab，2012，105：221-227.

[3] 熊琳，李维红，高雅琴，等.肉品中β-受体激动剂类药物残留检测技术研究进展[J].食品安全质量检测学报，2015，6（2）：528-533.

[4] 颜春荣，张波，方萍，等.猪肉中19种β-受体激动剂的液相色谱串联四级杆-飞行时间质谱（Q-TOF）筛查和确证方法研究[J] .分析试验室，2015，34（1）：35-39.

[5] 白艳艳，陈丽惠，贾玉琳.市售动物性食品中11种β-受体激动剂残留结果分析[J] .中国卫生检验杂志，2014（22）：3289-3290.

[6] 刘敬先，苗翠，刘笑，等.超高效液相串联质谱法分析牛肉中残留的β-受体激动剂[J] .药物分析杂志，2014，34（10）：1836-1841.endprint