普洱茶茶氨酸的含量测定及其抗氧化活性的研究

肖作为，郑楠楠，陆广琴，张智敏，黄建华*（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

普洱茶茶氨酸的含量测定及其抗氧化活性的研究

肖作为，郑楠楠，陆广琴，张智敏，黄建华*
（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

目的研究普洱茶中茶氨酸的含量及其抗氧化活性。方法采用高效液相色谱方法对普洱茶中茶氨酸含量进行测定，分析条件为：Aglient TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：(A)0.1%磷酸水溶液(B)甲醇；流速：1.000 0 mL/min；进样体积：10 μL；柱温：25℃；检测波长：203 nm。对分析条件进行优化和验证，构建了茶氨酸含量精确分析方法，进而通过清除1，1-二苯基-2-苦基肼基自由基（DPPH）法来测定其抗氧化活性。结果：30个普洱茶氨酸含量范围为7.350 1～14.235 3 mg/g，平均值为9.638 3 mg/g，抗氧化性在29.06%～72.28%之间。结论高效液相色谱法能够准确测定普洱茶中茶氨酸含量，对普洱茶抗氧化活性研究有利于对普洱茶保健疗效的进一步鉴定和提高。

高效液相色谱法；茶氨酸；1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基；抗氧化性

普洱茶是以中国云南特有的大叶种晒青茶(Camellia sinensis var.assamica)为原料经过特殊发酵工艺制成的黑茶[1]。不同的发酵程度对茶的化学活性成分有一定的影响，相比绿茶、乌龙茶、红茶在加工过程中分别进行未发酵、部分发酵、全发酵来说，普洱茶属于后发酵产物。普洱茶在人工“渥堆”过程中经历了微生物的酶促作用以及湿热作用，加之后发酵技术塑造了其具独特的色、香、味全品质特征。茶叶中含有的活性物质如茶多酚、茶多糖、生物碱、微量元素等成分，具有降血脂、降血糖、抗衰老、美容减肥以及神经保护功能等功效[2-3]。

普洱茶作为茶类保健饮品，特殊的后发酵工艺使其在活性成分含量和药理作用方面与其他茶类相比有显著的不同。栗志文等[4]通过整体动物模型研究比较普洱茶提取物与绿茶提取物的降糖功效，结果表明普洱茶提取物的降糖功效优于绿茶提取物。研究表明，茶叶中的氨基酸不仅具有缓解精神压力、抗运动疲劳、抑制肝损伤、抗癌等功效，同时能够促进大脑和神经的生长，预防帕金森氏症、老年痴呆症及传导性神经功能紊乱等疾病[5-7]。氨基酸是构成茶叶的重要组成部分，其含量一般为干重的1%～4%。茶叶中氨基酸的种类甚多，目前经常研究的有26种。其中以茶氨酸的含量最高，通常茶氨酸要占氨基酸的50%以上。茶氨酸是茶叶中特有的一种非蛋白氨基酸，可以缓减苦涩，增强茶汤香甜味，对茶滋味具有重要作用[8]。本文利用高效液相色谱法测定了普洱茶中的茶氨酸含量并进一步测定其抗氧化活性，实验结果证明提出的方法能够准确测定普洱茶的茶氨酸含量及抗氧化活性，为普洱茶的开发和利用提供了依据。

1 实验材料

全波长酶标仪购买自Thermo Fisher Scientific公司；30个普洱茶样品取自云南省普洱市，茶叶经过粉碎、过筛、置于自封袋，然后在避光、干燥、室温的条件下保存；DPPH试剂购自Sigma公司。

2 方法

2.1 茶氨酸含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Aglient TC-C18(4.6× 250 mm,5 μm）柱；流动相：(A)0.1%磷酸水溶液(B)甲醇；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 μL；柱温：25℃；检测波长：203 nm。

2.1.2 样品预处理 将30个普洱茶样本用粉碎机粉碎，过60目筛，于60℃烘箱中烘干4 h，用密封袋密封、避光、干燥，于室温条件下保存。其中甲醇为色谱纯试剂、磷酸分别为分析纯试剂。茶氨酸的标准品购自中国食品药品检定研究院。

2.1.3 对照品的制备 准确称取6.000 0 mg茶氨酸标准品，溶解在二次蒸馏水中，定容到1 mL容量瓶中，配成6 mg/mL的标准溶液，依次稀释得到0.05、0.10、0.20、0.40、1.00、2.00 mg/mL梯度浓度，于4℃下保存备用。

2.1.4 供试液的制备 称取样品1.000 0 g于锥形瓶中，按照物料比1:50加入50 mL二次蒸馏水，超声提取[9]。超声温度控制为60℃，超声时间为30 min，超声完成后冷却静置、过滤，再取上清液过0.45 μm的膜，滤液于4℃下保存，以备分析测试。2.1.5 高效液相梯度 溶剂条件按照表1中梯度进行。

表1 HPLC梯度洗脱

2.2 清除DPPH活性的测定

2.2.1 样品的提取方法 根据参考文献[10]进行优化，采用超声提取的方法，使用70%的乙醇，料液比为1：25，超声时间为40 min，超声温度为70℃，超声完成后，抽滤取其上清液，定容到50 mL的容量瓶中。

配置2.5 mmol/mL的Trolox标准溶液，作为对照品溶液。将其稀释至不同的浓度，使得Trolox的线性在 58.593 8、49.019 6、39.370 1、29.644 3、19.841 3、9.960 2 μmol/mL范围内。

取5 μL的样品溶液和空白(甲醇溶液)加入到96孔板中，每个样本做2个平行样，然后加入等量的DPPH甲醇溶液，避光，室温下反应30 min后，在515 nm下测量吸光度。

按照下列公式计算抑制率：

S:清除率，A:空白样品的吸光值，B:待测液的吸光值。

3 结果与讨论

3.1 普洱茶氨基酸样品测定

采用上述方法对普洱茶中的茶氨酸进行分析测定，根据茶氨酸标准品的色谱峰确定茶氨酸的保留时间(t=5.27 s)，不断优化色谱条件，使样本中茶氨酸可以与周围的物质实现较好的分类，所得到的标准品和样本的色谱峰图如图1所示。根据茶氨酸标准曲线代入茶氨酸的峰面积可计算出样本中茶氨酸的含量。

图1 标准品和样品的茶氨酸色谱峰

3.2 分析方法学验证

3.2.1 线性关系考察 分别精密吸取2.1.3制备的对照品溶液5 μL注入液相色谱仪中，测定其峰面积积分值。得到的标准曲线如图2所示，回归曲线的R2大于0.999，表明线性关系良好。

以回归曲线浓度 (mg/mL)为横坐标，峰面积(mAU*s)为纵坐标绘制茶氨酸的标准曲线图，LOD 和LOQ分别为S/N=3和S/N=10时标准品的浓度，通过计算可得到 LOD=9.343 75 μg/mL，LOQ= 31.145 80 μg/mL。

3.2.2 精密度、重复性、稳定性和回收率的考察

取一份对照品溶液，连续进样6次，进行仪器的精密度考察；制备6份同一份样本，进行重复性考察；取一份供试液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，进行稳定性考察；取6份同一样本按照2.3.3所示进行回收率考察。计算得到峰面积的相对标准偏差分别为1.16%、1.71%、0.40%和2.31%，数值均小于3%，说明仪器精密度、方法重复性、供试液稳定性良好。

图2 茶氨酸的标准曲线图

3.2.3 样品含量测定 按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，并采用构建的方法对30个普洱茶进行分析测定。精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定茶氨酸的含量。根据茶氨酸标准品的HPLC图确定茶氨酸的保留时间，并由外标法定量出茶叶中茶氨酸的含量。最终HPLC所测得的30个普洱茶样本的茶氨酸含量平均值为9.638 3 mg/g，得到的分析结果见表2。

表2 普洱茶茶氨酸含量及抗氧化性

3.3 样品抗氧化测试

利用2.2中提出的方法抗氧化性对30个普洱茶的抗氧化性进行测试得到的抗氧化性结果列于表2。

4 结论

作为茶类保健饮品，普洱茶具有延缓衰老、预防癌症、增强机体免疫力、改善动脉粥样硬化及美容等功效。其独特的保健功能与普洱茶经过特殊后发酵过程中有效化学成分发生变化是息息相关的。因此，对道地茶叶进行活性成分含量测定，并对其抗氧化性进行测定，将有利于对高品质、有益健康的普洱茶的开发和应用。

[1]陈 保，刘新月，蒲泓君，等.不同普洱茶原料渥堆发酵过程中主要化学成分的变化研究 [J].食品安全质量检测学报，2015，6 （4）：1 279-1 286.

[2]黄春桃，杜万红.茶叶的药理作用研究新进展 [J].中南药学，2010，8（9）：692-695.

[3]罗 堃，何 群，葛云鹏，等.Folin-Ciocalten比色法测定安化黑茶中茶多酚的含量[J].湖南中医药大学学报，2013，33（5）：65-66，74.

[4]栗志文，王媛媛，王根辈，等.普洱茶提取物与绿茶提取物降糖功效的研究[J].茶叶科学，2014，34（5）：428-434

[5]高小红，袁 华.茶氨酸的研究进展[J].化学与生物工程，2004，21 （1）：7-9.

[6]白宝丰.茶氨酸抗运动性疲劳机制及应用前景的思考[M].中国实验方剂学杂志，2011，17（12）：279-282.

[7]王海燕，张新卿.茶的神经保护作用 [M].中华老年医学杂志，2006，25（12）：942-945.

[8]Juneja LR,Chu DC,Okubo T,et al.L-theanine—a unique amino acid of green tea and its relaxation effect in humans[J]. Trends in Food Science and Technology,1999,10(6):199-204.

[9]Vuong QV,Stathopoulos CE,Golding JB,et al.Optimum conditions for the water extraction of L-theanine from green tea[J]. Journal of separation science,2011,34(18):2 468-2 474.

[10]杨海涛.超声辅助提取棕榈叶中总黄酮的工艺研究[J].安徽农业科学,2011,39(28):17 558-17 558.

（本文编辑 匡静之）

The Research of the Content of L-Theanine in Pu-erh Tea and its Antioxidant Activity

XIAO Zuowei,ZHENG Nannan,LU Guangqin,ZHANG Zhimin,HUANG Jianhua*
(Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo study the contents of L-Theanine in Pu-erh teas and its antioxidant activity.MethodsThe content of L-Theanine was determined by HPLC which performed on an Agligent TC-C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm)with a mobile phase of 0.1%phosphoric and methanol at a flow rate of 1.0 mL/min,a column temprature of 25℃,and a detection wavelength of 203nm,and weighing the antioxidant activity of the Pu-erh tea by 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH).ResultsThe content of L-Theanine in 30 batces of Pu-erh tea was 7.350 1-14.235 3 mg/g,and the average value was 9.638 3 mg/g. The antioxidant activity was between 29.06%-72.28%.ConclusionThe content of L-Theanine was determined accurately by HPLC.The antioxidant activity of Pu-erh tea will promote the dentify and enhance of its health care effect.

high performance liquid chromatography;L-Theanine;1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl;antioxidant activity

TS272，R284

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.12.013

2015－11-25

肖作为，男，硕士，讲师，主要从事中药保健食品研发、营养与保健研究等工作。

*黄建华，男，博士，讲师，E-mail:huanjianhua1995@163.com。