黄芪多糖和三七总皂苷配伍对糖尿病大鼠肾组织Ⅳ型胶原及层黏连蛋白表达的影响

蒋 赛,彭晓珊,黄志华,王硕辉，谢 月,唐映红，2*（.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 40208；2.湖南中医药大学中药现代化重点实验室，湖南 长沙 40208）

黄芪多糖和三七总皂苷配伍对糖尿病大鼠肾组织Ⅳ型胶原及层黏连蛋白表达的影响

蒋 赛1,彭晓珊1,黄志华1,王硕辉1，谢 月1,唐映红1，2*
（1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中药现代化重点实验室，湖南 长沙 410208）

目的探讨黄芪多糖（APS）和三七总皂苷(PNS)配伍对糖尿病大鼠肾组织Ⅳ型胶原及层黏连蛋白的影响。方法通过腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，将糖尿病模型大鼠随机分为模型组、APS组、PNS组、APS组+PNS组和贝那普利组，除模型组外，每天给药1次，连续给药 8周。8周后测定大鼠24 h尿总蛋白、血糖、血肌酐和尿素氮；采用免疫组化法测定糖尿病大鼠肾组织内转化生长因子β1（TGF-β1）、血小板源性生长因子（PDGF-BB）、Ⅳ型胶原蛋白（Col-Ⅳ）和层粘连蛋白（LN）的表达。结果与正常对照组比较，模型组大鼠24 h尿总蛋白、血糖、血肌酐和尿素氮含量显著升高（P＜0.01），肾组织中TGF-β1、PDGF-BB、Col-Ⅳ和LN蛋白表达显著增强（P＜0.01）；与模型组比较，APS、PNS、APS与PNS配伍组大鼠的24 h尿总蛋白、血糖、血肌酐和尿素氮显著降低(P＜0.01），肾组织中TGF-β1、PDGF-BB、Col-Ⅳ和LN蛋白表达显著减少（P＜0.01），APS与PNS配伍组的作用优于APS、PNS单用组（P＜0.05，P＜0.01）。结论APS和PNS配伍对糖尿病大鼠的肾脏具有保护作用，其作用机制可能与其下调TGF-β1、PDGF-BB、Col-Ⅳ和LN蛋白表达，从而抑制细胞外基质合成有关。

黄芪多糖；三七总皂苷；配伍研究；糖尿病大鼠；转化生长因子β1；血小板源性生长因子；Ⅳ型胶原蛋白；层粘连蛋白

黄芪多糖 (Astragalus Polysaccharidde，APS)是黄芪的有效组分之一，研究表明：APS可改善糖尿病肾病患者的临床症状[1]，对糖尿病大鼠肾脏具有保护作用[2]APS可降低肾脏水通道蛋白2 mRNA的过度表达，使糖尿病肾病大鼠肾足细胞nephrin和podocin蛋白表达增加[3-4]。三七总皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）是三七的活性组分，研究表明：在常规治疗基础上加用PNS治疗早期糖尿病肾病疗效显著[5]，PNS可减少糖尿病大鼠肾组织丙二醛、糖基化终产物含量、降低糖尿病大鼠肾组织血管内皮生长因子及转化生长因子-β的表达，减少细胞外基质在肾小球的聚积[6-7]。APS 和PNS对糖尿病大鼠肾脏保护作用及其作用机制有较多报道研究，但二者对糖尿病大鼠肾组织Ⅳ型胶原蛋白（Col-Ⅳ）和层粘连蛋白（LN）的影响如何，二者配伍后对糖尿病大鼠肾脏是否具有协同保护作用，目前尚未见实验报道。本研究旨在观察APS 和PNS对糖尿病大鼠肾组织Col-Ⅳ和LN蛋白表达的影响以及二者合用后对糖尿病大鼠肾脏是否具有协同保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级SD雄性大鼠80只，体质量（200±20）g，由湖南斯莱克景达实验动物公司提供，动物许可证号：SCXK(湘)2011-0003。大鼠饲以标准颗粒饲料，12 h交替光线照明，室内通风良好，室温20～25℃，相对湿度40%～50%。

1.2 试剂及药品

黄芪多糖（APS）：批号UD130927，含量77%，由陕西昂盛生物医药科技有限公司提供；三七总皂苷（PNS）：批号 130628，含量93.8%，由自广西梧州制药（集团）股份有限公司提供；盐酸贝那普利片：批号AE20130902，深圳信立泰药业股份有限公司生产；链脲佐菌素（STZ）:批号9058035，北京 Solarbio科技有限公司生产；总蛋白试剂盒（批号131181），血糖试剂盒 （批号133161），肌酐试剂盒 （批号132831），尿素氮试剂盒（批号131071）：均由中生北控生物科技股份有限公司提供；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体：批号20140103，规格0.2于mL/支，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗大鼠PDGF-BB多克隆抗体（批号20140218），兔抗大鼠CoL-Ⅳ多克隆抗体（批号20140706），山羊抗兔二抗（批号20130706）：均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗大鼠LN多克隆抗体：（批号20140920）武汉博士德生物工程公司。

1.3 仪器

ONETOUCH血糖测量仪及血糖试纸 （强生公司）；PUS-2018G半自动生化分析仪 （北京普朗新技术有限公司）；Shandon325石蜡切片机 （英国Shandon公司）；Motic B5型显微摄像系统 （麦克奥迪实业集团公司）；MIAS医学图象分析系统 （北航公司生产）。

1.4 动物模型的建立

大鼠适应性饲养1周后，禁食16 h，大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）60 mg/kg（用 0.1 mol/L、pH 4.4柠檬酸缓冲液在冰浴上配制 1%STZ），剩余大鼠作为正常对照组，注射等体积的柠檬酸缓冲液。STZ注射 72 h后，以尿糖+++，血糖高于16.7 mmol/L者确定为糖尿病大鼠[8]。造模成功后，将成模大鼠分为模型组、APS组、PNS组、APS+PNS组和贝那普利组，并设正常对照组，APS组灌胃给予APS 300 mg/(kg·d)，PNS组灌胃给予PNS 100 mg/ (kg·d)，APS+PNS组灌胃给予PNS 100 mg/(kg·d)+ APS 300 mg/(kg·d)，贝那普利组灌胃给予贝那普利0.9 mg/(kg·d)，给药体积为10 ml/kg,模型组和正常对照组大鼠灌胃给予等体积蒸馏水，每天给药 1次，连续给药 8周。

1.5 指标检测

第 8周末次给药后，将大鼠置于代谢笼中，收集大鼠 24 h尿液，测定尿量后离心，取上清液用双缩脲法测定大鼠尿液中总蛋白的含量。大鼠称体重后，用 10% 水合氯醛 0.35 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血约 10 mL，分离血清，采用葡萄糖氧化酶法测定大鼠血清中葡萄糖的含量；采用苦味酸法测定大鼠血清中血肌酐的含量；采用酶偶联速率法测定大鼠血清中尿素氮的含量。取左肾用pH 7.4、10%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片后进行免疫组化检测。肾组织切片4 μm，二甲苯、酒精脱蜡，蒸馏水冲洗；磷酸缓冲液组织抗原修复，3%双氧水室温避光封闭 5-10 min；分别滴加一抗兔抗大鼠TGF-β1、PDGF-BB、CoL-Ⅳ、LN多克隆抗体(稀释度l∶100)。4℃冰箱过夜，PBS液冲洗；滴加二抗，室温30 min，PBS液冲洗，室温 DAB显色5～10 min，出现阳性反应，蒸馏水冲洗终止反应；苏木素复染，脱水，透明，封片。每张切片在高倍镜下(× 400)拍摄5个视野，采用MIAS显微图像分析系统测定每个肾小球视野的光密度值，计算平均光密度值（AOD），将AOD作为蛋白表达的定量标准。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较

正常对照组大鼠精神状况良好，皮毛有光泽，活动自如，反应灵敏；糖尿病模型组大鼠精神萎靡、明显消瘦、多尿、多饮，毛色发黄无光泽，反应迟钝；各给药组大鼠存活大鼠精神状况、反应灵敏度均比模型组大鼠要有明显的改善。

2.2 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠血糖、肌酐和尿素氮的影响

与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠血糖、肌酐、尿素氮含量均显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，APS、PNS组及APS与PNS配伍组大鼠血糖、肌酐、尿素氮含量明显降低（P＜0.05，P＜0.01），APS与PNS配伍组的作用优于各APS、PNS单用组 （P＜0.05，P＜0.01）。结果见表 1。

表1 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠血糖、肌酐和尿素氮的影响 （±s）

表1 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠血糖、肌酐和尿素氮的影响 （±s）

注：与正常对照组比较**P＜0.01；与模型组比较 △P＜0.05，△△P＜0.01，与APS组比较，▲▲P＜0.01；与PNS组比较，▽P＜0.05,▽▽P＜0.01。

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2.3 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠肾组织 TGF-β1蛋白表达的影响

正常对照组大鼠肾小球系膜有少量的 TGF-β1表达，模型组大鼠肾小球系膜和基底膜 TGF-β1蛋白表达显著增强，AOD显著升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；APS单用组、PNS单用组、APS与PNS配伍组大鼠肾组织TGF-β1蛋白表达显著减少，AOD显著降低，与模型组比较，差异有统计学意义 （P＜0.01），APS与PNS配伍组的作用优于APS与PNS单用药组（P＜0.01）。结果见图1与表2。

图1 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠肾组织TGF-β1蛋白表达的影响（×400）

表2 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠肾组织TGF-β1和PDGF-BB蛋白表达的影响 （±s）

表2 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠肾组织TGF-β1和PDGF-BB蛋白表达的影响 （±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，△△P＜0.01；与APS比较，▲▲P＜0.01；与PNS组比较，▽▽P＜0.01。

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2.4 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠肾组织PDGFBB蛋白表达的影响

正常对照组大鼠肾小球系膜和基膜有少量的PDGF-BB蛋白表达，模型组大鼠肾小球系膜和肾小球基底膜PDGF-BB蛋白表达显著增强，AOD升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），与模型组比较，APS单用组、PNS单用组、APS与PNS配伍组肾组织PDGF-BB蛋白表达均显著减弱，AOD值显著升高，与模型组比较，差异有显著统计学意义 （P＜0.01）。APS与PNS配伍组的作用优于APS组、PNS单用组（P＜0.01）。结果见图2与表2。

2.5 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠肾组织Col-Ⅳ蛋白表达的影响

图2 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠肾组织PDGF-BB蛋白表达的影响（×400）

正常对照组大鼠肾组织中 Col-Ⅳ 蛋白少有表达；模型组大鼠肾组织中 Col-Ⅳ 蛋白表达显著增强，Col-Ⅳ 蛋白表达主要位于肾小球系膜、肾间质以及肾小管上皮细胞的胞浆中，模型组AOD 升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义 （P＜0.01），APS组、PNS组、APS与PNS配伍组大鼠肾组织Col-Ⅳ蛋白表达显著减少，AOD显著降低，与模型组比较，差异有统计学意义 （P＜0.01），APS与 PNS配伍组的作用优于 APS、PNS单用组（P＜0.01）。结果见图 3和表 3。

图3 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠肾组织Col-Ⅳ蛋白表达的影响（×400）

2.6 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠肾组织 LN蛋白表达的影响

正常对照组大鼠肾小球系膜有少量的LN蛋白表达，模型组大鼠肾组织LN蛋白表达显著增强，LN蛋白表达主要在肾小球系膜和肾小管上皮细胞，模型组AOD升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义 （P＜0.01），APS组、PNS组大鼠肾组织 LN蛋白表达减少，AOD降低，但与模型组比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）,APS与PNS配伍组肾组织LN蛋白表达显著减少，AOD显著降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），APS与PNS配伍组的作用优于PNS、APS单用组（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠肾组织Col-Ⅳ和LN蛋白表达的影响 （±s）

表3 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠肾组织Col-Ⅳ和LN蛋白表达的影响 （±s）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与APS组比较，▲▲P＜0.01；与PNS组比较，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01。

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图4 APS和PNS配伍对糖尿病大鼠肾组织LN蛋白表达的影响（×400）

3 讨论

转移生长因子-β1(TGF-β1)是最重要的促纤维化因子，可促进系膜细胞的合成和抑制细胞基底膜的降解，加速系膜细胞外基质的积聚；可增大细胞直径造成肾小球的肥大[9]。STZ诱导的糖尿病大鼠在出现高血糖24 h后，肾小球TGF-β1表达显著增高[10]，并随着糖尿病病程的进展，肾脏TGF-β1的表达量不断增加[11]。说明通过抑制TGF-β1在肾脏的过度表达可以有效控制肾小球硬化进展，防治糖尿病肾病的发生。

血小板源性生长因子 （Platelet-derived growth factor,PDGF-BB）是多肽类生长因子中对系膜细胞促有丝分裂作用最强的一种，它能与PDGF-α受体结合诱导TGF-β1的合成导致系膜增生；与PDGF-β受体结合诱导系膜细胞，促进细胞有丝分裂，促进ECM合成，并且能够收缩血管，影响肾脏的功能[12]。通过PDGF-BB拮抗剂的治疗，能够减少肾小球系膜细胞的增殖和肾小球硬化[13]，而用TGF-β1抗体阻断了TGF-β1的表达，PDGF-BB的表达也不再升高[14]，可见TGF-β1与PDGF-BB共同促进肾脏的损害。

Ⅳ型胶原蛋白（Collagen Type，Col-Ⅳ）和层粘连蛋白 （Laminin,LN）主要存在于细胞外基质（ECM），是肾小球基底膜的主要构成成分。文献证实糖尿病患者Col-Ⅳ，LN升高与肾脏 ECM生成增加有密切关系[15-16]。在长期处于 DM 时，多种细胞因子的上调使Col-Ⅳ的合成增加，促进ECM的聚集，从而改变肾小球基底膜的结构，影响肾小球的滤过作用，导致肾小球硬化[17]。临床研究表明在蛋白尿增多之前，糖尿病患者体内的Col-Ⅳ的蛋白表达就已增多，并随病变的加重而增加[18-19]。实验研究也表明糖尿病大鼠肾脏肾小球系膜基质分数增大，Col-Ⅳ蛋白表达增多，出现明显的肾小球硬化[20]。LN是一组糖蛋白，由通过二硫键结合的3条多肽链α、β和γ组成，是基底膜的重要组成成分，位于基底膜透明层，能够影响基底膜的电荷选择性，并与Col-Ⅳ一起形成基底膜骨架[21]。有研究证实，比起微量白蛋白排泄率，在糖尿病肾病患者体内，LN出现的更早，且更加准确，更能作为糖尿病肾病早期的诊断指标[22]。由此可见，Col-Ⅳ，LN可以反映肾脏病变情况[23]。

本实验研究表明，采用STZ建立糖尿病大鼠模型，8周后糖尿病大鼠肾脏TGF-β1和PDGF-BB蛋白表达水平显著升高，肾组织内Col-Ⅳ和LN蛋白表达同样显著增加，结果与文献报道一致，证明DM大鼠确实存在着基底膜增厚，系膜增生的情况。而给予APS、PNS后，糖尿病大鼠肾组织的TGF-β1、PDGF-BB、Col-Ⅳ和LN蛋白表达较模型组降低。APS与PNS配伍组的作用优于APS、PNS单用组，提示APS与PNS配伍后对糖尿病大鼠肾脏的保护作用增强，其对糖尿病肾脏的保护作用可能与其抑制TGF-β1、PDGF-BB、LN和Col-Ⅳ蛋白表达，减少细胞外基质合成有关。

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（本文编辑 苏 维）

Effect of Astragalus Polysaccharides Combined with Panax Notoginseng Saponins on the Expression of Col-Ⅳ and LN in Renal Tissues of Diabetic Rats

JIANG Sai1,PENG Xiaoshan1,HUANG Zhihua1,WANG Shuohui1，XIE Yue1，TANG Yinghong1,2*
(1.Department of Pharmacology,College of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Huna 410208,China; 2.Key Lab of Modernization of Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo investigate the effect of astragalus polysaccharides (APS)combined with panax notoginseng saponins (PNS)on the expression of Col-IV and LN in renal tissues of diabetic rats.MethodsDiabetic rat model was induced by injecting streptozotocin intraperitoneally.The diabetic rats were randomly divided into the model,APS,PNS,APS +PNS,benazepril groups.The rats were administered medicine intragastrically one time a day for 8 weeks.Urinary protein level in 24h,blood sugar,blood creatinine and urea nitrogen were determined.The protein expression of transforming growth factor beta 1(TGF-β1),platelet-derived growth factor(PDGF-BB),type IV collagen(Col-IV)and laminin(LN)in the renal tissue were determined by immunohistochemistry.ResultsCompared with the normal control group,unrinary protein level in 24 h,blood glucose,creatinine and urea nitrogen level in rats in the model group were significantly higher than those in normal control group (P＜0.01);The protein expression of TGF-β1,PDGF-BB,Col-IV and LN in the renal tissue were enhanced (P＜0.01).Compared with the modelgroup,unrinary protein levelin 24 h,blood glucose,creatinine and urea nitrogen level were reduced (P＜0.01);The protein expression of TGF-β1,PDGF-BB,Col-IV and LN in the renal tissue in rats were decreased significantly (P＜0.01);The effects of APS combined with PNS were better than those of APS and PNS alone groups(P＜0.05,P＜0.01).ConclusionThe combination between APS and PNS had protective effect on kidney of diabetic rats.Its mechanism may be related to inhibiting extracellular matrix synthesis by downregulating the protein expression of TGF-β1,PDGF-BB,Col-IV and LN.

astragalus polysaccharides;panax notoginseng saponins；compatibility study;diabetic rats;transforming growth factor beta 1;platelet-derived growth factor;collagen typeⅣ;laminin

R285.5

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.12.005

2015－11－23

湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目 （湘教通 [2012]402-187）；2012地方高校国家级大学生创新训练计划项目（201210541005）。

蒋 赛，男，学士，研究方向：中药药理。

*唐映红，女，教授，硕士研究生导师，E-mail：tyhong62@qq.com。