支原体脂肽经EGFR/MMP-9诱导气道上皮细胞分泌MUC5AC

文道林 余敏君 游晓星 李冉辉 陈列松 朱翠明 李媛媛 曾焱华

支原体脂肽经EGFR/MMP-9诱导气道上皮细胞分泌MUC5AC

文道林 余敏君 游晓星 李冉辉 陈列松 朱翠明 李媛媛 曾焱华

目的 观察支原体巨噬细胞活化脂肽-2（MALP-2）诱导人气道上皮细胞分泌粘蛋白MUC5AC的分子机制。方法 体外培养人气道上皮细胞NCI-H292，分别采用0、0.1、1.0和5.0μg/mL MALP-2刺激NCI-H292细胞24h，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测培养上清中MUC5AC和基质金属蛋白酶9（MMP-9）的含量；Western blot检测表皮生长因子受体（EGFR）磷酸化水平。同时采用EGFR抑制剂AG-1478或MMP-9抑制剂（MMP-9 Inhibitor I）处理细胞，观察其对MUC5AC分泌的影响。结果 NCI-H292细胞未刺激时，MUC5AC以及MMP-9分泌水平极低。当给予0.1～5μg/mL MALP-2作用18h后，MUC5AC的分泌水平显著增高。此外，5μg/mL MALP-2作用NCI-H292细胞1h后可诱导EGFR磷酸化。采用AG-1478预处理细胞1h后，MMP-9及MUC5AC分泌水平明显减少，同时，采用10nmol/L MMP-9抑制剂处理后也能下调MUC5AC水平。结论 支原体MALP-2经EGFR/MMP-9诱导气道上皮细胞分泌MUC5AC。

支原体巨噬细胞活化脂肽2；基质金属蛋白酶9；MUC5AC

黏液是分布于气道表面的一层粘弹性凝胶，它和纤毛共同形成黏液纤毛运输系统，是机体固有免疫系统的重要组成部分[1]。虽然黏液对拮抗病原微生物感染发挥重要作用，但病理条件下气道黏液过度分泌对影响黏膜纤毛的清除功能。临床多种疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、囊性纤维化和支气管扩张，往往伴随有黏液的过度分泌，从而加重疾病的病情[2-4]。气道黏液的主要成分是水、离子和粘蛋白组成（其中粘蛋白约占2%）。粘蛋白是由位于上皮杯状细胞和黏膜下层腺体中的黏液细胞分泌。目前已经鉴定的粘蛋白基因至少有12种，其中以MUC5AC最重要[5]。肺炎支原体是引起社区获得性肺炎最常见的病原微生物，在多种慢性呼吸系统疾病如哮喘中发挥重要作用。研究表明，肺炎支原体感染后，可上调气道上皮细胞分泌MUC5AC[6]，但其分子机制尚未完全明了。本研究以支原体巨噬细胞活化脂肽2（macrophage-activating lipopeptide-2，MALP-2）为研究对象，观察其处理NCI-H292细胞后，对MUC5AC分泌有何影响，并初步探讨其调控机制，从而进一步明确支原体的致病机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂 RPMI-1640培养基、胎牛血清为Invitrogen公司产品（Frederick，MD）；人基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）ELISA检测试剂盒购自深圳欣博盛生物有限公司，人MUC5AC ELISA检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。鼠抗人磷酸化表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）抗体以及total-EGFR抗体购自Cell signaling（Beverly，MA）。AG1478和基质金属蛋白酶-9抑制剂购自Calbiochem（Darmstadt， Germany）。

1.2 细胞培养与处理 人气道上皮细胞系NCI-H292用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，于37℃、5%CO2条件下培养。待细胞生长丰度达到70%时，将其接种至无血清培养基中继续培养24h以同步细胞周期。MALP-2刺激前将NCI-H292接种至24孔板中（细胞数约5×105），加入终浓度为0、0.1、1.0和5.0μg/mL MALP-2刺激0～4h或24h，随后获取上清或提取总蛋白用于下一步研究。

1.3 MMP-9和MUC5AC检测 细胞处理结束后，通过反复冻融以裂解细胞。经1000r/min离心5min后，弃沉淀，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测上清中

MMP-9和MUC5AC的含量。操作方法按照试剂盒提供的操作步骤进行。结果以相对含量表示（处理组吸光值/对照组吸光值×100%）。

1.4 EGFR磷酸化分析 细胞处理结束后，采用预冷PBS洗涤1次，随后加入100μL裂解液[50mmol/L Tris（pH7.4），150mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS，1μL蛋白酶抑制剂，1μL磷酸酶抑制剂以及1μL PMSF]冰上裂解15min。4℃离心获取上清，测定蛋白浓度后，获取40μg蛋白用于凝胶电泳。随后通过电转印至硝酸纤维素膜上，经5%脱脂奶粉封闭后，分别与抗磷酸化EGFR抗体（1∶1000）和EGFR抗体（1∶1500）孵育。充分洗膜后加入辣根过氧化物酶标记二抗，ECL显影、拍照。

1.5 统计学方法 所有实验数据重复3次，应用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料用“x±s”表示，组间比较采用单因素方差分析数据。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MALP-2诱导NCI-H292细胞EGFR磷酸化NCI-H292细胞未经MALP-2刺激时，EGFR磷酸化水平极低。当给予MALP-2刺激0～4h后，细胞内磷酸化EGFR含量显著增多，而对细胞内EGFR总量无明显影响。见图1。

图1 MALP-2作用不同时间对NCI-H292细胞EGFR磷酸化的影响

2.2 MALP-2诱导NCI-H292细胞分泌MMP-9 当给予0.1、1.0、5.0μg/mL MALP-2作用24h后，可显著诱导NCI-H292细胞分泌MMP-9，且随着MALP-2浓度的增加，MMP-9的分泌水平进一步增多。见图2。

图2 不同浓度MALP-2诱导NCI-H292细胞分泌MMP-9

2.3 EGFR抑制剂处理下调MALP-2诱导分泌MMP-9 NCI-H292细胞在MALP-2处理前，首先用5～10μmol/ L EGFR AG-1478预处理细胞1h，随后再用MALP-2刺激24h，AG-1478处理后，MMP-9分泌水平明显降低（P＜0.05）。见图3。

图3 AG-1478抑制MALP-2诱导NCI-H292细胞分泌MMP-9

2.4 抑制MMP-9活性后降低MUC5AC的分泌5μg/mL MALP-2作用NCI-H292细胞后，可显著诱导其分泌MUC5AC。而给予10nmol/L MMP-9抑制剂预处理细胞后，MUC5AC含量显著减少（P＜0.05）。见图4。

图4 MMP-9抑制剂下调MALP-2诱导NCI-H292细胞分泌MUC5AC

3 讨论

肺炎支原体是导致儿童及成人呼吸系统感染最常见的病原体，并与多种疾病的急性发作有关，如哮喘与COPD。虽然病毒感染是导致哮喘急性发作的重要因素，但该病也与随后引起的肺炎支原体二重感染有关[7]。在这些疾病的急性发作时，粘蛋白的过度分泌是重要的病理学特征。本研究证实支原体致病物质MALP-2可通过EGFR/MMP-9通路诱导NCI-H292细胞分泌MUC5AC，这可能是支原体导致多种慢性肺部疾病急性发作的重要致病因素。

研究表明，MMPs参与多种慢性气道疾病，如COPD、哮喘和囊性纤维化的发病过程，尤其是在气道炎症反应中，MMP-9发挥重要作用[8]。然而，以往的研究大多局限于MMPs对气道重塑和肺实质的破坏作用[9]，而MMPs对粘蛋白高分泌的调控作用和机制并不完全清楚。本研究通过ELISA证实，MALP-2处理NCI-H292细胞后，可显著诱导其分泌MMP-9。MMPs异常分泌后可引起细胞外基质降解从而导致炎症反应的异常，如导致血管通透性增加和炎性细胞的渗出等。活化的MMP-9可降解的细胞表面相关分子而产生具有活性的生物成分，并可以通过裂解细胞-细胞之间黏附蛋白来影响细胞的行为[10]。本研究结果显示，MALP-2处理后可诱导EGFR磷酸化，而NCI-H292细胞给予EGFR抑制剂处理后，MMP-9的分泌水平显著降低，表明MMP-9的分泌与EGFR的磷酸化有关。随后的研究也证实MALP-2可上调MUC5AC的表达，而给予MMP-9抑制剂处理后，MUC5AC的含量明显减少，表明MMP-9参与了MUC5AC的分泌。在本研究中，我们并未对EGFR相关配体进行检测，MMP-9诱导MUC5AC的分泌可能是通过MMP-9降解细胞表面相关EGFR的配体分子，或释放一些相关生物活性物质而最终诱导MUC5AC的合成。此外，MALP-2是TLR2和TLR6的配体。MALP-2经TLR2/6识别后，可上调一系列细胞因子或炎性介质的产生，而这些炎性因子也可能诱导粘蛋白的表达[11]。

总之，本研究证实MALP-2通过EGFR/MMP-9诱导MUC5AC分泌，因此，MMP-9除了具有损伤肺泡、气道重构以及降解细胞外基质外，同时也能上调粘蛋白的分泌。在随后的研究当中，我们将对EGFR的上游通路开展研究，从而进一步明确肺炎支原体的致病机制。

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Objective To investigate the molecular mechanism of the Macrophage-activating lipopeptide-2 (MALP-2) on secretion of MUC5AC in human airway epithelial cells. Methods The airway epithelial cell line NCI-H292 was cultured in vitro and stimulated with 0, 0.1,1.0 and 5.0 μg/ mL of MALP-2 for 24h. Secretion of MUC5AC and matrix metalloprotein-9 (MMP-9) in the supernatant were detected by ELISA; Phosphorylation of epithelial growth factor receptor (EGFR) was measured by Western blot. To observe the effect of EGFR and MMP-9 on the mediation of MUC5AC secretion, specific inhibitor AG-1478 and MMP-9 Inhibitor I was used before MALP-2 stimulation. Results The secretion level of MUC5AC and MMP-9 was very low in untreated cells. 0.1-5μg/mL of MALP-2 incubation for 18h signifi cantly upregulated MUC5AC secretion. In addition, 5μg/mL MALP-2 could induce EGFR phosphorylation after 1h of incubation. Treatment of AG-1478, an inhibitor of EGFR, signifi cantly abrogated MALP-2-induced MMP-9 and MUC5AC secretion. Furthermore, 10nmol/L MMP-9 inhibitor could also inhibit MUC5AC production. Conclusion Mycoplasma MALP-2 induces MUC5AC secretion via the EGFR/MMP-9 pathways in human airway epithelial cells

Macrophage-activating lipopeptide-2; Matrix metalloprotein-9; MUC5AC

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.28.001

国家自然科学基金 （31370207）

湖南 421001 南华大学病原生物学研究所 （文道林 余敏君 游晓星 李冉辉 陈列松 朱翠明 李媛媛 曾焱华） 广东 518106 深圳市光明新区人民医院 （文道林） 湖南 422000 邵阳市中心医院检验科 （李媛媛）

曾焱华 E-mail：zengyihua21cn@126.com