牛乳溶菌酶的安全性评价

张璐莹，罗春海，许启有，李诗莹，邹晓，付世新

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

子宫内膜炎是奶牛主要疾病之一，对畜牧经济有着直接的经济影响。子宫内膜炎主要发生的原因为细菌感染[1]，而目前临床治疗仍旧以抗生素为主要治疗方法，伴随着耐药性和药物残留问题的日益凸显，临床治疗上需要可以替代抗生素的新型药物[2]。溶菌酶作为一种绿色药物[3]，受到了人们的关注，其具有杀菌效果强、菌谱广、稳定性好等优点[4-5]。以此为基础，实验室通过毕赤酵母表达系统制备了重组牛乳溶菌酶，并对其纯化浓缩后获得重组牛乳溶菌酶粉剂，不仅具有以上的生物学作用，同时具有同源性的优势。实验主要通过对牛乳溶菌酶进行溶血试验和刺激性试验，进行安全性评价，为进一步临床试验提供保障和依据。

1 材料

1.1 实验动物

健康白兔家兔6 只，体重2.0～2.5 kg。

1.2 溶菌酶

实验室制备的重组牛乳溶菌酶粉剂。

1.3 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌由黑龙江八一农垦大学诊断实验室提供。

2 方法

2.1 牛乳溶菌酶抑菌效果的确定

2.1.1 牛乳溶菌酶溶液和菌液的制备

取实验室已获得的纯化浓缩后的重组牛乳溶菌酶粉剂，用蒸馏水配制成浓度为10.0 mg·mL-1的牛乳溶菌酶溶液[6]。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌在营养琼脂平板上划线分离培养，挑取少量单个菌落加入肉汤培养基中，37 ℃恒温箱培养 24 h，分别制成肉汤培养基。

2.1.2 牛乳溶菌酶抑菌效果的测定

取15 只试管于试管架上，分别加入已制成的含菌肉汤培养基1 mL。在1 号试管中加入1 mL 牛乳溶菌酶溶液，之后倍比稀释，最后一支试管不加。再分别加入100 μL 金黄色葡萄球菌菌液，混匀。大肠杆菌、无乳链球菌同样操作，37 ℃恒温箱培养24 h，观察并记录结果。

2.2 牛乳溶菌酶溶血性试验

2.2.1 2%兔红细胞混悬液的配制

健康家兔心脏取血20 mL，于带有玻璃珠的锥形瓶中，振荡摇晃10 min。将除去纤维蛋白原的血液转移到离心管内，加入10 mL 生理盐水，混匀，2 500 r·min-1离心5 min。弃上清后加入生理盐水，混匀后继续离心。重复步骤，用生理盐水洗涤3 次，至上清不为红色为止。取管底2 mL 红细胞液，与98 mL 生理盐水配制成2%的兔红细胞混悬液。

2.2.2 溶血试验

在试管架上排列7 支试管并标号，将牛乳溶菌酶溶液、生理盐水、2%兔红细胞混悬液和蒸馏水按表1 加入试管中。其中，6 号试管不加牛乳溶菌酶溶液作为空白对照，7 号试管只加2%兔红细胞混悬液和蒸馏水作为阳性对照。将1～6 号试管置于37 ℃恒温箱中，分别在1 h、2 h、3 h 时观察并记录溶液变化情况[7]。

表1 溶血试验各溶液加样值Table 1 Sample solution of Hemolysis test

2.3 牛乳溶菌酶刺激性试验

选取正常健康白色家兔6 只，排除眼角膜、虹膜和结膜有病变和炎症变化的，试验进行自身对照。试验时在右眼滴加0.1 mL 生理盐水，左眼滴加0.1 mL的牛乳溶菌酶溶液，然后使兔子闭合眼睛10 s 左右。在滴眼后2、6、12、24、48、72 h 对家兔左右眼进行检查，根据表2 进行眼刺激反应评分[8]，并按照表3 进行眼刺激强度评价。

表2 眼刺激反应评分标准Table 2 Score standard of eye irritative action

表2 眼刺激反应评分标准Continued table 2 Score standard of eye irritative action

表3 眼刺激评价标准Table 3 Level standard of eye irritative action

3 结果

3.1 牛乳溶菌酶抑菌效果的确定结果

抑菌试验结果，牛乳溶菌酶对金黄色葡萄球菌抑菌效果明显，大肠杆菌、无乳链球菌的抑菌效果相对较弱。金黄色葡萄球菌从13 号试管开始出现浑浊，表明其中有细菌生长，大肠杆菌和无乳链球菌分别从3 号和6 号开始出现细菌生长现象，具体抑菌结果见表4。

表4 牛乳溶菌酶抑菌试验结果Table 4 Results of LYZ-1 bacteriostatic test

3.2 牛乳溶菌酶溶血性试验结果

在3 个时间点中除7 号试管的阳性对照溶液呈澄明红色外，其余6 支试管内溶液均未呈澄明红色，上层液体为无色透明，红细胞全部下沉，振荡摇晃试管可见红细胞在溶液中均匀分散。溶血试验结果表明，牛乳溶菌酶溶液无溶血和凝集作用。试验结果见表5。

表5 溶血性试验结果Table 5 Results of hemolysis

3.3 牛乳溶菌酶刺激性试验结果

家兔左眼用药后，在6 h 后有轻度的眼角膜充血现象，12 h 出现少量分泌物，无水肿现象，随着时间的延后，刺激性逐渐减弱，24 h 后充血现象消失，但分泌物依然存在，48 h 后基本表现正常（见表6）。根据评分结果，牛乳溶菌酶对黏膜无刺激。

表6 牛乳溶菌酶刺激性试验结果Table 6 Results of eye irritetive action

4 讨论

牛乳溶菌酶作为一种新型的生物制剂，应用于临床治疗，不仅能够抑制细菌的生长，还能增强牛自身的免疫力[9]，并且可以促进子宫内膜的恢复[10]。奶牛子宫内膜炎主要致病菌为大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌[11]，牛乳溶菌酶对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有明显的抑菌效果，对大肠杆菌等革兰氏阴性菌也有一定抑菌效果。根据药典2010 版，试验进行了动物安全性试验，为牛乳溶菌酶应用于临床提供保障。易明梅等讨论验证了溶菌酶基因药物应用于奶牛后，对乳汁、尿液以及其他分泌物、排泄物等进行检测，结果显示溶菌酶基因药物对环境同样是安全的。因此，初步完成了牛乳溶菌酶应用于临床前的安全性试验，其临床效果还有待临床试验时进一步探索和验证。

［1］王洪海，王国卿，郭梦尧，等.中药治疗奶牛子宫内膜炎研究进展［J］.中国收益杂志，2010，46（8）：64-65.

［2］孙蕾，常喆，王军.治疗奶牛子宫内膜炎复方制剂的安全性评价［J］.黑龙江畜牧兽医，2011（5）：128-129.

［3］Yu Q，Li J.Lysozyme and its applications［J］.Academic Periodical of Farm Products Processing，2007，109：34-38.

［4］戴晏，朱建国，孙怀昌，等.重组溶菌酶基因工程质粒治疗奶牛乳房炎的效果分析［J］.中国兽药杂志，2009，43（11）：39-41.

［5］沈诚，林源，朱建国，等.重组溶菌酶质粒pcDNAKLYZ 治疗泌乳期奶牛乳房炎［J］.中国奶牛，2011（4）：4-6.

［6］郭醉元.溶菌酶与中药治疗奶牛子宫内膜炎的比较研究［D］.哈尔滨：东北农业大学，2008.

［7］邓元荣，卓仪荣，王玲.油茶皂苷的体外溶血试验研究［J］.海峡药学，2008，20（12）：29-32.

［8］郭世宁.防止奶牛子宫内膜炎新型复方药物制剂宫炎清的研究［D］.哈尔滨：东北农业大学，2002.

［9］Supungul P，Rimphanichayakit V，Aoki T，et al.Molecular characterization and analysis of a ctype and two novel muramidasedeficient itype lysozymes form Penaeus monodon ［J］.Fish and Shellfish Immunol，2010，28（3）：490-498.

［10］Callewaert L，Vanoirbeek KG，Luriquin I，et al.The Rcs two-component system regulates espression of lysozyme inhitors and is induced by exposure to lysozyme［J］.J Bacteriol，2009，191（6）：1979-1981.

［11］陈雪龙，罗春海，齐长学，等.大庆 地区奶牛子宫内膜炎致病菌的分离与鉴定［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2013，25（3）：42-44.