Axl和Mer受体调控小鼠红细胞分化

唐红梅，贾长虹，李巍伟，李 明

(华北理工大学 生命科学学院， 河北 唐山 063000)



研究论文

Axl和Mer受体调控小鼠红细胞分化

唐红梅*，贾长虹，李巍伟，李 明

(华北理工大学 生命科学学院， 河北 唐山 063000)

目的研究Axl和Mer受体是否参与红细胞分化的调控。方法单基因(AXL-/-和MER-/-)和双基因(AXL-/-MER-/-)敲除小鼠，利用组织切片观察小鼠骨髓、肝脏和脾脏的组织结构；计数小鼠单根股骨内骨髓细胞的数量；用实时定量PCR检测与红细胞分化相关基因mRNA的表达。结果双基因敲除的小鼠单根股骨骨髓内总细胞、单个核细胞和成熟红细胞的数量分别下降了40%、34%和53%(P<0.01)；骨髓细胞排列稀疏，血窦内、外成熟红细胞数量明显减少；虽然外周血中红细胞数量和血红蛋白的含量没有改变，但存在着明显的髓外造血，肝脏里出现了造血岛，脾脏中红髓明显地增生。而单基因敲除小鼠骨髓中红细胞数量以及组织结构未见改变。且双基因敲除小鼠中红系细胞内GATA- 1和EpoR的mRNA表达分别降低了65%和75%(P<0.01)。结论Axl和Mer受体通过GATA- 1和EpoR来调节红细胞的分化，并且功能上存在重叠、过剩和代偿。

Axl；Mer；基因敲除；红细胞分化

哺乳动物红细胞的生成是造血干细胞在造血微环境中增殖、分化、成熟和释放的复杂过程。在此过程中，细胞要接受多种生长因子、受体的调控，同时有多条信号通路的参与。TAM受体是Tyro3、Axl和Mer 3个受体的简称，是一个发现较晚的受体酪氨酸激酶亚家族。这3个受体分子结构相似，都是单次跨膜蛋白，由细胞黏附分子相关的胞外配体结合域、跨膜区和有酪氨酸激酶结构域的胞内区组成，所以TAM受体既具有黏附分子的特点，又具有酪氨酸激酶活性[1]。TAM受体广泛表达于生理及病理状态下的免疫[2]、神经[3- 4]、生殖[5- 6]、造血[7]等系统的细胞中，具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和介导细胞黏附、识别、吞噬凋亡细胞等作用[8]。在血液中，它们参与巨核细胞[9]、NK细胞[10]和DC细胞[11]的分化，调节止血和天然免疫。而在红系细胞内共表达Axl和Mer，不表达Tyro3受体[12]，故本研究以基因敲除小鼠为研究对象，探讨Axl和Mer受体对红细胞分化的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

AXL-/-(简称A)、MER-/-(简称M)单基因敲除小鼠(美国加州Salk生物研究院分子神经生物学实验室Lemke博士和卢清显博士惠赠)；AXL-/-MER-/-(简称AM)双基因敲除小鼠由单基因敲除小鼠配种繁育而成。正常C57BL/6小鼠(Wild Type，简称WT)[中国医学科学院实验动物研究所，合格证号SCXK(京)2004- 0001]。实验小鼠的年龄是10～15周，雌雄兼有。

1.2 试剂

HE染色试剂盒、红细胞裂解液(碧云天生物公司)；PBS缓冲液(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)；Trizol(Invitrogen 公司)；实时定量PCR(quantitative real time PCR，qPCR)引物(北京赛百盛生物公司)；qPCR试剂盒(Applied Biosystems公司)；Anti-Ter119-PE抗体、Anti-PE超微磁珠(BD公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫磁珠法分离Ter119+细胞：含有0.5%血清白蛋白、0.08% EDTA、pH值为7.2的PBS(简称PBE)作为孵育液。用PBE悬浮待分离骨髓细胞，加入适量的anti-Ter119-PE抗体混匀，4 ℃孵育30 min后清洗细胞；再加入适量的anti-PE抗体包被的超微磁珠混匀后，置室温孵育10～15 min；安装分离柱于磁场中，预处理分离柱；将孵育的细胞悬液注入分离柱中，自然下流，并清洗分离柱两次；取出分离柱，注入PBE，收集细胞。

1.3.2 qPCR：提取红系细胞中RNA进行qPCR反应，以β-actin做内参。qPCR扩增反应50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃ 1 min×40次，总反应体积为20 μL。使用ABI PRISM 7000实时定量PCR仪进行基因扩增。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 AM小鼠骨髓组织结构的改变

WT小鼠股骨内的骨髓细胞排列紧密，组织内含丰富的血窦，窦内充满成熟的红细胞。而AM小鼠骨髓内造血细胞排列稀疏，窦内、外成熟红细胞数量明显减少。但是A和M小鼠骨髓组织结构未见异常(图1)。

2.2 AM小鼠骨髓内总细胞和成熟红细胞数量减少

AM小鼠的总骨髓细胞数量和单个核细胞数量分别减少了40%和34%(P<0.01)。而且与骨髓组织切片观察到的结果相一致，AM小鼠骨髓内成熟红细胞的数量下降非常严重，只有WT小鼠的47%(P<0.01)(表1)。

2.3 AM小鼠外周血中红细胞形态结构、数量和血红蛋白含量正常

AM小鼠外周血中的红细胞(RBC)数量、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)等指标未见异常。血涂片检查AM小鼠红细胞的形态结构亦未见改变。但是老年(大于9月龄)AM小鼠出现严重贫血(表2)，红细胞的数量和血红蛋白含量只有WT小鼠的1/2左右(P<0.01)；红细胞压积亦降低了29%(P<0.05)。

Arrows point sinusoid(scale bar=20 μm)

grouptotalcellsnucleatedcellsredcellsWT271±006192±018078±002A269±009175±016072±002M272±010179±012087±003AM163±004∗126±014∗037±003∗

*P<0.01 compared with WT group.

表2 各种基因型老年小鼠血液中红细胞的参数

*P<0.05,**P<0.01 compared with WT group.

2.4 AM小鼠出现髓外造血

AM小鼠的肝脏和脾脏肿大，且脾脏肿大更明显。AM小鼠脾脏的平均重量是WT小鼠的3.5倍(图2A)，肝脏的平均重量是WT小鼠的0.3倍(图2B)。不过M小鼠的脾脏亦出现肿大。AM小鼠肝组织中有许多巨核细胞和成团的造血岛；脾组织中可见红髓增生甚至侵润到白髓中、血窦扩张充血、单位面积中的巨核细胞数量明显增加。

A.splenic weight of mice; B.liver weight of mice; *P<0.05, **P<0.01 compared with WT group

2.5 AM小鼠红系细胞内GATA- 1和EpoR表达量明显降低

AM小鼠骨髓红系细胞中GATA- 1和EpoR表达量明显降低，分别是WT小鼠的1/3和1/4(P<0.01)(图3)。

*P<0.01 compared with WT group图3 红系细胞中与红细胞分化相关分子的mRNA的差异表达Fig 3 Relative mRNA levels analyzed by quantitative real time PCR in the sorted erythroid cells from

3 讨论

本实验利用基因敲除小鼠做为实验动物，有效地反映了Axl和Mer受体对红细胞生成的影响。单基因敲除的A和M小鼠骨髓内成熟红细胞数量正

常，但是双基因敲除的AM小鼠骨髓内成熟红细胞数量下降了50%，这说明Axl和Mer受体均参与了红细胞分化的调控。这与TAM受体调控巨核细胞分化[9]和精子发生[5- 6]的作用相似，几个受体共表达在同一细胞时，功能上往往出现了重叠、过剩和代偿。

虽然AM小鼠由于髓外造血的补偿作用未出现贫血，但是随着年龄的增长，受损的骨髓造血功能无法逆转，肝、脾脏代偿造血的能力达到极限，就会失代偿而出现严重的贫血。AM小鼠寿命的缩短，只有WT小鼠的1/2～2/3倍，这可能与机体后期严重的贫血相关。

GATA- 1是红细胞分化必需的特异性转录调节因子。GATA- 1基因敲除后发现，小鼠的胚胎会在中期死亡，红系分化停止在成红细胞阶段[13]。Epo亦是调控红细胞分化的重要细胞因子。Epo基因敲除后，小鼠的胚胎将在发育中期死亡，其受体是EpoR、Epo与EpoR结合后可诱导细胞内多条信号途径[14]，从而调控红细胞发育。本实验结果表明，AM小鼠骨髓的红系细胞内GATA- 1和EpoR表达明显下降，因此推测Axl和Mer受体可能通过调控GATA- 1和EpoR的表达来调节红细胞分化，但是作用到红细胞分化的阶段和信号通路并不清楚，有待于深入研究。

[1] 邓婷婷, 韩代书. TAM受体的生物学功能[J]. 中国细胞生物学学报, 2010, 32:630- 636.

[2] Lu Q, Lemke G. Homeostatic regulation of the immune system by receptor tyrosine kinases of the Tyro 3 family [J]. Science, 2001, 293: 306- 311.

[3] Ammoun S, Provenzano L, Zhou L,etal. Axl/Gas6/NFkappaB signaling in Schwannoma pathological proliferation, adhesion and survival[J]. Oncogene, 2014, 33: 336- 346.

[4] Binder MD, Kilpatrick TJ. TAM receptor signalling and demyelination[J]. Neuro Signals, 2009, 17: 277- 287.

[5] Wang H, Chen Y, Ge Y,etal. Immunoexpression of Tyro 3 family receptors—Tyro 3, Axl, and Mer—and their ligand Gas6 in postnatal developing mouse testis [J]. J Histochem Cytochem, 2005, 53: 1355- 1364.

[6] Lu Q, Gore M, Zhang Q,etal. Tyro- 3 family receptors are essential regulators of mammalian spermatogenesis[J]. Nature, 1999, 398: 723- 728.

[7] O’Bryan JP, Frye RA, Cogswell PC,etal. Axl, a transforming gene isolated from primary human myeloid leukemia cells, encodes a novel receptor tyrosine kinase[J]. Mol Cell Biol, 1991, 11: 5016- 5031.

[8] Hafizi S, Dahlback B. Signaling and functional diversity within the Axl subfamily of receptor tyrosine kinases[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2006, 17: 295- 304.

[9] Wang H, Chen S, Chen Y,etal. The role of Tyro 3 subfamily receptors in the regulation of hemostasis and megakaryocytopoiesis[J]. Haematologica, 2007, 92: 643- 650.

[10] Caraux A, Lu Q, Fernandez N,etal. Natural killer cell differentiation driven by Tyro3 receptor tyrosine kinases[J]. Nat Immunol, 2006, 7: 747- 754.

[11] Rothlin CV, Ghosh S, Zuniga EI,etal. TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response[J]. Cell, 2007, 131: 1124- 1136.

[12] Tang H, Chen S, Wang H,etal. TAM receptors and the regulation of erythropoiesis in mice[J]. Haematologica, 2009, 94: 326- 334.

[13] Fujiwara Y, Browne CP, Cunniff K,etal. Arrested development of embryonic red cell precursors in mouse embryos lacking transcription factor GATA- 1[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93: 12355- 12358.

[14] Munugalavadla V, Kapur R. Role of c-Kit and erythropoietin receptor in erythropoiesis[J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2005, 54: 63- 75.

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Axl and Mer receptors regulate erythropoiesis in mice

TANG Hong-mei*, JIA Chang-hong, LI Wei-wei, LI Ming

(College of Life Science, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China)

Objective To study whether the Axl and Mer receptors are involved in the regulation of erythroid differentiation. Methods Single and double mutant mice for AXL and MER were used in the research. Histological sections of bone marrows, livers and spleens, cellularity of bone marrow, hematologic parameters, and the expression of erythroid factors were analyzed to evaluate the function of Axl and Mer in erythropoiesis. Results Histological analysis showed that the sinusoids in wild-type bone marrows were filled with red blood cells, whereas those in theAXL-/-MER-/-bone marrows were largely empty and contained fewer red blood cells. The number of the total cells, the nuclearted cells and the red blood cells in anAXL-/-MER-/-femur were decreased. A compensatory extramedullary erythropoiesis occurred inAXL-/-MER-/-mice. The hematopoietic islands appeared in the liver, and the red pulp is expanded in the spleen. Mice lacking single AXL or MER exhibited normal erythropoiesis in steady-state conditions. The relative mRNA levels of EpoR and GATA- 1 were significantly down-regulated inAXL-/-MER-/-erythroid cells.Conclusions Axl and Mer receptors may influence erythropoiesis through the regulation of GATA- 1 and EpoR expression in erythroid cells.

Axl; Mer; gene knockout; erythropoiesis

2015- 06- 03

2015- 09- 28

河北省自然科学基金(H2013209194)

1001-6325(2015)12-1628-05

R331.1

A

*通信作者(corresponding author)：thmyouxiang@163.com