低温胁迫对克恩氏冬青超微结构及细胞内Ca2+分布的影响

周余华　唐义明　赵明明

摘要：在低温胁迫条件下，分析克恩氏冬青细胞内的超微结构和Ca2+分布与抗寒性的关系。结果表明：随着低温胁迫的增强，细胞内细胞器受损程度也增强，到-16 ℃时，细胞膜系统出现了严重的损伤，同时细胞内Ca2+沉淀量随温度的降低而增加。

关键词：克恩氏冬青；低温胁迫；叶片细胞；超微结构；Ca2+分布

中图分类号： Q945.78 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0166-03

克恩氏冬青（Ilex×koehneana ‘Emily Bruner）为冬青属常绿阔叶小乔木，是近期引进的欧洲冬青杂交品种。许多冬青属在低温胁迫条件下有较好的耐寒性，可以引种到北方地区[1]，一般来说，植物细胞内Ca2+分布及超微结构会随着低温的变化而呈一定的相关性[2]，Ca2+作为胞内第二信使调节着植物体内的许多代谢和发育过程，因而起重要作用[3-6]。为进一步研究克恩氏冬青的生态适应性及其栽培和推广的制约因素，于2012年对克恩氏冬青的耐寒性进行系统研究，解析不同温度条件下克恩氏冬青的解剖结构和低温胁迫的关系，从而深入研究克恩氏冬青的细胞学机制，为克恩氏冬青选育及栽培提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

2012年6月将6种克恩氏冬青扦插于南京林业大学内，待生根后及时上盆，放置于树木园温室内待用。

1.2 方法

将样品在25 ℃下放置1周进行预冷，然后移至人工气候室（-40～25 ℃），以5 ℃为1个阶梯逐级降温，分别降到0、-8、-16 ℃时各维持48 h，及时采取低温处理好的植物顶端叶片迅速切成0.5 mm×0.5 mm的组织块，并沉入到用 0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH值7.2）配制的2%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合液中，室温黑暗初固定6 h；然后用含2%焦锑酸钾的缓冲液（pH值 7.6）洗涤3次，每次约0.5 h；再转移到含2%焦锑酸钾的缓冲液（pH值7.6）配制的1%锇酸中，在4 ℃冰箱内固定过夜。将2次固定过的组织块用重蒸水洗涤4次后，再用pH值为10.0的重蒸水（用0.1 mol/L KOH 调节pH值）洗涤2次，每次约0.5 h。随后经系列冷乙醇脱水，环氧丙烷过渡，Epon812（环氧树脂）包埋，LKB-V型超薄切片机切片，切片经0.5%醋酸双氧铀染色，在H-600 型透射电子显微镜下观察照相。

2 结果与分析

2.1 不同低温胁迫下克恩氏冬青叶片细胞的超微结构

2.1.1 0 ℃条件下克恩氏冬青叶片细胞的超微结构

由图1可知，叶绿体仍然紧贴细胞壁排列，细胞核大部分较正常，少部分细胞核的核膜变得模糊，同样近一端分布，液泡中有少量高电子密度的嗜锇物质分布；叶绿体中嗜锇颗粒含量仍然较少且不含淀粉粒，其中叶绿体类囊体片层排列虽然规则、有序，但少部分清晰可见，大部分已模糊不清，线粒体略正常。

2.1.2 -8 ℃条件下克恩氏冬青叶片细胞的超微结构

由图2可知，叶绿体仍然紧贴细胞壁排列，细胞核较正常，仍然近一端分布，液泡中含少量高电子密度的嗜锇物质；叶绿体中嗜锇颗粒含量仍较多，同样不含淀粉粒，其中类囊体片层排列仍然规则、有序；同样，叶绿体大部分类囊体片层排列规则、有序且清晰可见，少部分叶绿体类囊体片层模糊，线粒体略正常。

2.1.3 -16 ℃条件下克恩氏冬青叶片细胞的超微结构

由图3可知，叶绿体已不贴细胞壁排列，叶绿体及其他细胞器散落在细胞中；细胞中含有很少量的高电子密度嗜锇物质，多数叶绿体被膜消失，所含嗜锇颗粒含量较多，不含淀粉粒，其中叶绿体的类囊体片层扩张并且不清晰，细胞核、线粒体受损（图3中的箭头所指的部位为受损部位）。

2.2 低温条件对克恩氏冬青叶片中Ca2+分布的影响

2.2.1 0 ℃条件下克恩氏冬青叶片中Ca2+的分布情况

由图4可知，在0 ℃低温下，克恩氏冬青叶片中的细胞间隙有Ca2+沉淀，在细胞壁外侧、叶绿体膜和液泡膜上的Ca2+沉积比细胞器上多，细胞核上有少量沉淀。

2.2.2 -8 ℃条件下克恩氏冬青叶片中Ca2+的分布情况 由图5可知，在-8 ℃低温胁迫下，克恩氏冬青叶片的细胞壁外侧、细胞间隙上有Ca2+沉积，大多情况下叶绿体、细胞壁、液泡上有少量沉积。

2.2.3 -16 ℃条件下克恩氏冬青叶片中Ca2+的分布情况

由图5、图6可以看出，在-16 ℃低温处理下，Ca2+沉淀明显多于-8 ℃低温处理。类囊体片层或消失或模糊不清，叶绿体游离到细胞内，不再紧贴细胞壁，且多数严重肿胀，细胞中液泡内、细胞质和叶绿体中、细胞壁上有少量Ca2+沉积（图6）。

3 结论与讨论

随着气温越来越低，克恩氏冬青叶肉细胞超微结构出现明显变化。在 0 ℃条件下，克恩氏冬青叶绿体呈长椭圆形且多数紧贴细胞壁分布，细胞核靠近一端，叶绿体片层清晰可见，液泡和叶绿体中有少量高电子密度的嗜锇物质分布，不含淀粉粒。总体来说，叶片细胞较正常，叶色较正常。在 -8 ℃ 条件下，细胞核结构正常，叶绿体稍有膨胀，片层弯曲，嗜锇颗粒增加，出现了较多的环状片层。在-16 ℃条件下，叶片细胞结构遭到严重破坏，嗜锇颗粒增多且变大，细胞内大部分细胞器散乱于细胞内并变得模糊。可见，随着低温胁迫的增强，细胞核、叶绿体等细胞器受损程度也增强，细胞膜系统出现了严重的损伤，主要有叶绿体膜、细胞膜或解体或模糊不清。在0、-8 ℃胁迫下，克恩氏冬青叶片的基本结构没有改变，能适应此低温；而到-16 ℃时，细胞内线粒体受到破坏，说明此时植物体已发生冻害。克恩氏冬青细胞内的超微结构发生变化，说明与其抗寒性密切相关。试验中细胞内的线粒体、叶绿体同样是对低温比较敏感的2个细胞器，而质膜则是低温伤害的首要部位[7]，这说明植物与低温的适应性具有很重要的意义。

克恩氏冬青细胞内Ca2+分布随温度的变化而变化。在 0 ℃ 低温胁迫下，细胞质中的Ca2+浓度很低；到-8 ℃低温条件时，细胞内Ca2+浓度明显增加；到-16 ℃时，克恩氏冬青细胞内 Ca2+浓度增加，并沉淀成聚集状态分布，此时细胞内Ca2+浓度已经超出植物的承受能力，Ca2+浓度平衡被打破，从而破坏和扰乱细胞正常的结构与功能。细胞质内Ca2+变化通过启动细胞内生理生化过程，导致植物的外部抗寒性反应，起着传递和放大信号的作用[8]。此外，Ca2+浓度过度增加会扰乱以无机磷为基础的能量代谢系统[9]。由 Ca2+信使诱发的这一系列变化致使植物发生低温伤害。

参考文献：

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