高效液相色谱法测定广西4类土壤对百草枯的吸附力*

陆华，宁宗，程道海，丘瑛，黄俊杰

(1.广西医科大学第一附属医院药学部，南宁 530021;2.广西医科大学第一附属医院急诊科，南宁 530021;3.广西医科大学药学院本科2010级，南宁 530021)

我国是百草枯生产和使用最多、也是百草枯中毒者数量最多的国家［1］。虽然有关百草枯中毒的研究很多，但临床治疗效果仍然不能令人满意，病死率达50% ～80%［2］。院前救治决定中毒者的预后，快速减少百草枯在中毒者胃肠道的吸收是院前救治最有效措施之一。虽然蒙脱石、活性炭对百草枯具有很强的吸附力，在救治急性百草枯中毒具有肯定的疗效［2］，但在院前施救时很难获得，尤其是在中毒者现场及周围。有文献提供院前施救减少百草枯吸收的各种方法:如立即给予患者大量经过煮沸的湿泥浆水口服，而且越早越好［3］;也有家属当即给予物理刺激催吐，自行洗衣粉液洗胃后再送到医院，之后痊愈出院［4］;也有口服漂白土［5］、饮入肥皂水后催吐及饮入 10% 黏土溶液［6］等。尽管口服漂白土悬液作为急性百草枯中毒的救治措施之一，并且已经达成专家共识［7］。然而中毒患者早期能获得漂白土救治仍是非常困难的。因此，笔者在本实验中利用高效液相色谱法考察广西各地常见的具有代表性并且容易获得的土壤(包括红土、黄土、白陶土和稻田土)在水、人工胃液及人工肠液介质中对百草枯的吸附率，并与蒙脱石的吸附率进行比较，从中筛选出吸附力强、分布广泛、取材便利的土壤，为救治急性百草枯中毒提供可临时替代使用的吸附剂。

1 试药与仪器

1.1 试药 乙腈(色谱纯，TEDIA公司，批号:606140);庚烷磺酸钠(分析纯，天津市大茂化学试剂厂，批号:20131119);磷酸(分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号:20110819);三乙胺(分析纯，天津市大茂化学试剂厂，批号:20121018);甲醇(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂，批号:20110810);百草枯对照品(上海市农药研究所，批号:20110318，含量:98.8%);百草枯商品液(兰考苏豫精细化工厂，批号:20130305，浓度:20%，规格:每瓶200mL);磷酸二氢钾(分析纯，成都科龙化工试剂厂，批号:20091102);浓盐酸(分析纯，东莞市盛能化工有限公司，批号:20101205);蒙脱石(试剂级，市售);红土、黄土、白陶土、稻田土均从广西当地农村采集。

1.2 仪器 LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津公司);SPD-6AV UV-VIS检测器(日本岛津公司);N2000双通道色谱工作站(浙江大学智达信息工程有限公司);DF110电子分析天平(江苏常熟衡器厂，感量:0.1 mg);PHS-3C精密 pH计(上海雷磁仪器厂);SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);SB2200超声仪(上海BRANSON公司);85-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器厂)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18柱(4.6mm×200mm，5 μm);流动相:乙腈-水(含 0.03 mol·L－1庚烷磺酸钠、0.24 mol·L－1磷酸)=3∶97(用三乙胺调pH至2.0);检测波长258 nm;柱温25℃;进样体积20 μL;流速 0.8mL·min－1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 百草枯标准液的制备 精密称取百草枯对照品0.005 3 g置于50mL量瓶，用纯化水稀释至刻度，配制成106 mg·L－1百草枯对照品储备液。用纯化水稀释至 10.6 μg·mL－1，进样。

2.2.2 百草枯母液的制备 精密量取市售百草枯商品液1mL置于100mL量瓶，用纯化水稀释至刻度，配制成浓度为2 mg·mL－1的百草枯母液，置4℃冰箱保存备用。

2.2.3 人工胃液的配制 参考《中华人民共和国药典》2010年版二部附录XA，量取浓盐酸25mL置于100mL量瓶，用纯化水稀释至刻度，配制成浓度为10%的稀盐酸。再量取10%稀盐酸8.2mL，用纯化水定容至500mL配制成人工胃液，置4℃冰箱保存备用。

2.2.4 人工肠液的配制 参考《中华人民共和国药典》2010年版二部附录附录XVD，称取磷酸二氢钾3.4 g，加纯化水约400mL溶解，用氢氧化钠调pH至6.8，定容至500mL量瓶，配制成人工肠液，置4℃冰箱保存备用。

2.2.5 供试溶液的配制

2.2.5.1100 μg·mL－1百草枯溶液的配制 精密量取2 mg·mL－1百草枯母液2.5mL至50mL量瓶，分别用纯化水、人工胃液、人工肠液定容。

2.2.5.210%土壤混悬液的配制 分别称取各种土壤样本5 g，其中A组:红土;B组:黄土;C组:白陶土;D组:蒙脱石;E组:稻田土，分别用纯化水、人工胃液、人工肠液溶解，混匀并定容至50mL锥形瓶，经水煮沸后获得。

2.2.5.3 土壤吸附百草枯溶液配制 分别称取各种土壤样本5 g，加入按“2.2.5.1”项配制的溶液中，配成含10%浓度土壤及100 μg·mL－1百草枯的混悬液。

2.3 色谱行为考察 取106 mg·L－1百草枯对照品储备液经用纯化水稀释至 10.6 μg·mL－1，进样测定，色谱图见图 1A;100 μg·mL－1百草枯溶液经内径 0.45 μm微孔滤膜滤过后取样进高效液相色谱，色谱图1B。百草枯商品液出峰时间与对照品的出峰时间一致，且峰形无干扰，说明可利用市售百草枯商品溶液做供试品进行吸附率研究。土壤 A 按“2.2.5.2”项和“2.2.5.3”项配制的水介质混悬液处置后进样，色谱图见图1C和图1D。其余各类土壤在不同溶剂中的高效液相色谱图均与土壤A在水溶液产生的色谱图类似。比较图1A图1B说明百草枯商品液出峰时间和对照品一致;比较图1B和图1C看出土壤A在百草枯出峰的保留时间产生的杂质峰很小，对百草枯的峰形影响很小，可忽略。

2.4 土壤吸附百草枯考察实验 分别将配制好的“2.2.5.2”项和“2.2.5.3”项混悬液放置在恒温磁力搅拌器平台上，转速为100 r·min－1，于室温下搅拌30min，取出静置，待混悬液分层后，取上层清液用定量滤纸(18 cm，新华造纸厂)粗滤后，再用内径0.45 μm微孔滤膜滤过，续滤液按“2.1”项色谱条件进样。每种供试品重复进样3次，记录色谱图和峰面积，并计算峰面积平均值。各种土壤在3种不同介质中吸附百草枯的考察实验均按照“2.2.5.1”项、“2.2.5.2”项和“2.2.5.3”项处理后进样，所获得的各项峰面积统计数据见表1。吸附率(%)=(1－Y/X)×100%，X代表吸附前百草枯的峰面积，Y代表土壤吸附百草枯后滤液中残存百草枯峰面积。结果见表1。

3 讨论

A.10.6 μg·mL－1百草枯对照品;B.100 μg·mL－1百草枯溶液;C.10%土壤 A 混悬液;D.10% 土壤 A 吸附 100 μg·mL－1百草枯后滤液;1.百草枯;2.土壤杂质峰图1 土壤A与百草枯在水介质中吸附实验的高效液相色谱图A.10.6 μg·mL－1paraquat control solution;B.100 μg·mL－1paraquat solution;C.10%soil A solution;D.100 μg·mL－1paraquat solution absorbed with 10%soil A;1.paraquat;2.impurity peak of soil Fig.1 HPLC Chromatogram of paraquat in adsorption test on soil A

表1 不同土壤在3种介质中的百草枯吸附比较Tab.1 Comparison of paraquat adsorption by different soil among three kinds of media

目前常用于百草枯中毒的吸附剂为漂白土和活性炭。每100 g漂白土可吸附百草枯6 g［2］。漂白土由皂土(bentonite，膨润土)或黏土加工而成，以蒙脱石粉为主要矿物质成分，通常配成15%漂白土悬浮液和7%皂土悬浮液，可少量频服，1 000mL顿服患者多不耐受而呕吐，影响吸附效果［8］。活性炭100 g可吸附百草枯8～10 g，可用活性炭悬浮液洗胃导泻。百草枯中毒多发生于农村，农户及当地基层医院获得上述吸附剂非常困难，因此应用受到一定限制。而泥土悬液则由随处可见的普通黏土经水煮沸获得［9］，获取方便，在百草枯中毒现场即可实施急救，如其对百草枯有较好吸附作用，并能广泛应用于百草枯中毒的救治，将提高抢救成功率。

有文献报道［9-10］，采用不同泥土或土壤制成混悬液、灌胃后观察对百草枯的吸附作用，但文献利用紫外-可见分光光度计测定百草枯含量的方法值得商榷，因为市售的百草枯原料药和商品液都有颜色(可能添加有催吐剂、着色剂等成分)，农药本身颜色会影响到紫外-可见分光光度法的含量检测结果，所得出的泥土对百草枯吸附率的研究数据不可靠。董存元等［11］采用高效液相色谱法研究不同吸附剂对百草枯的吸附率，高岭土(含有蒙脱石成分)吸附率最高，为62.10%，与本研究结果不同，可能存在实验条件的因素。而查阅国外相关研究文献［12－13］均指出农药百草枯能被各种土壤几乎全部吸附，有些吸附率达到99.99%［13］，其吸附主要机制是带有正电荷百草枯被土壤中带负电荷的矿物质和有机物分子吸附，当然其他的分子间范德华力、氢键作用也起到吸附作用。因此，在体外实验研究不同吸附剂对百草枯的吸附能力时，选择科学合理的实验方法和条件是关键。

笔者在本实验采用的色谱条件是在参考高效液相色谱法测定人血清百草枯浓度相关文献基础上确定的，用于临床测定中毒患者的血清百草枯浓度。

为了获得更好的累积峰面积、便于计算吸附率，本课题选择浓度为100 μg·mL－1的百草枯商品液考察土壤吸附率。另外，文献［6，9，11］报道选择10%土壤混悬液，目的是便于土壤混匀搅拌和滤过，并且如果选择较高的浓度进行考察，比如高于30%的土壤混液灌胃易引起堵管［12］，影响临床急救可操作性。

计算土壤吸附率公式时可忽略土壤本身产生的杂质峰面积，本研究结果显示，土壤杂质峰面积相对百草枯峰面积所占比例非常小，根据结果，并比较100 μg·mL－1浓度百草枯溶液的色谱图和土壤A吸附100 μg·mL－1浓度百草枯溶液后的色谱图，提示广西4类常见土壤对百草枯具有很强吸附作用。

由于无特效拮抗剂，百草枯中毒第一时间进行催吐和洗胃吸附是救治的关键措施［14-15］。本研究显示，广西地区具有代表性的并且获取便利的各类土壤的混悬液(包括:红土、黄土、白陶土、稻田土)对百草枯的吸附率均＞99.0%，其吸附能力与蒙脱石相同，说明这些土壤具有良好的吸附百草枯能力，可以作为百草枯中毒患者现场救治临时替代品，并且口服土壤混悬液也起到一定的催吐作用，可以在基层进行推广使用，有利于基层医院，尤其是应用于农村对百草枯中毒者的院前救治。

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