含植物提取物固体饮料中总黄酮的检测

高丽霄，林汉卿，刘梅森，臧成国（深圳市味奇生物科技有限公司，广东深圳518109）

含植物提取物固体饮料中总黄酮的检测

高丽霄，林汉卿，刘梅森*，臧成国
（深圳市味奇生物科技有限公司，广东深圳518109）

摘要：建立一种简单、准确度高、适用性强的方法，用于检测含植物提取物固体饮料中总黄酮的含量。对样品处理的提取溶剂浓度、超声时间、提取料液比进行优化，并对该测定方法低浓度范围内的标准曲线及测定方法的精密度和准确度进行分析。样品最佳处理条件为：提取溶剂为70%乙醇，超声时间30 min，提取料液比1∶2.5（g/mL），该方法的RSD在1.03%～7.83%范围内，精确度较好，平均加样回收率为98.44%，标准曲线在低浓度0～20 μg/mL范围内的线性方程为Y=0.012 7X-0.002 4，R=0.999 3，线性关系良好。该法操作简单，对于含植物提取物固体饮料中总黄酮的测定适用性好，准确度高，可为固体饮料中总黄酮测定方法标准的制定提供参考。

关键词：总黄酮；测定；分光光度法；植物提取物固体饮料

固体饮料产品是指以糖、乳或乳制品、蛋或蛋制品、果汁或植物提取物等为原料，添加适量的辅料或食品添加剂制成的固体制品[1]。市场为了迎合国内外追求健康、回归自然的消费观念，将卫生部公布的药食两用天然植物原料越来越多地应用于固体饮料中。黄酮是天然植物的代表性功效成分，它是具有苯骈吡喃环结构的一类天然化合物的总称，总黄酮的含量常作为含植物提取物固体饮料的评价指标[2]。总黄酮测定方法主要为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）和分光光度法[3-6]。HPLC法测定需要多种标准对照品，且检测过程复杂，分光光度法根据同类物质经显色后在在同一波长下具有共同吸收来测定样品中含量，只需一种对照品，操作简单快速，耗费低，因此，目前现行有效的食品、药品或保健品标准中总黄酮测定方法主要是以芦丁作为标准对照品，采用分光光度计法进行测定[7-10]。但这些标准针对含植物提取物固体饮料中总黄酮的检测还存在问题如下：（1）样品取样量偏低，标准曲线总黄酮浓度范围偏高。固体饮料产品属于普通食品，其中添加的植物提取物一般为水提取的比例提取物，且与其他配料混合后，总黄酮含量较低，而现行有效的药典或保健食品标准针对的产品属于药品或保健品，总黄酮含量较高，在测定时样品取样量低，普遍在0.15 g～1.5 g之间，若直接引用这些标准会造成含植物提取物固体饮料中总黄酮检测值不在标准曲线的适宜范围内，因此需降低标准曲线范围，增大取样量，并选择合适的料液比，使产品中总黄酮被充分提取[11-12]。（2）现行标准中提取总黄酮的有机溶剂浓度不适宜，造成产品测试液为浊液，无法通过分光光度计测定。含植物提取物固体饮料产品中糖分含量普遍较高，且有可能添加经过处理的蛋白类成分或脂类成分，按照现有的总黄酮检测标准操作后，可能会造成溶液粘度大，过滤分离困难，且测试液为乳浊液等问题，因此需优化提取总黄酮的有机溶剂溶度，并采用超声处理使得产品中总黄酮充分溶出[13]。（3）现有标准中样品总黄酮测定的操作具有特征性和针对性，不具有广泛应用性[14-16]。如《保健食品检验与评价技术规范》中总黄酮测定须经聚酰胺层析柱纯化，而针对成分复杂且黄酮含量低的产品，可能存在吸附和解吸不彻底等问题，造成检测值偏差较大[12]；而国家标准《柑橘类水果及制品中总黄酮含量的测定》中，总黄酮测定标准品选用了橙皮苷，不具有普遍性[16]。针对以上问题，本研究对含植物提取物固体饮料中总黄酮测定的处理条件进行优化，以期得到准确度和重现性好、适用性强的总黄酮测定方法。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

植物提取物固体饮料：购自当地超市；芦丁标准对照品：广州药检所；5%亚硝酸钠溶液（避光保存）；4%氢氧化钠溶液；10%硝酸铝溶液；无水乙醇，国产分析纯。

AL104电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；752-P紫外可见分光光度计：上海现科仪器有限公司；RE52CS旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHA-B水浴恒温振荡器：金坛市岸头良友实验仪器厂；HRX-30C超声波发生器：深圳市慧冉超声设备有限公司。

1.2测定方法

1.2.1标准曲线的制备

芦丁标准品储备液：称取120℃干燥至恒重的芦丁标准品100 mg，用适量稀乙醇溶液加热溶解，冷却至室温后，定容至100 mL；准确移取上述溶液5.0 mL 于100 mL容量瓶中，加稀乙醇溶液定容，摇匀，备用。

准确移取芦丁标准品储备液0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、8.0、10.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，各加水至10 mL，添加1 mL亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，再加入1 mL硝酸铝溶液，继续静置6 min后，加10 mL氢氧化钠溶液并用水定容至刻度，静置15 min。以未加芦丁标准品储备液为空白对照，在波长500 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.2样品处理

精确称取适量样品，置于锥形瓶中，用一定量稀乙醇溶液溶解，密封，超声处理后，在30℃下回旋振荡浸提10 h，静置过夜后过滤，滤液进行减压浓缩，浓缩液定容于25 mL容量瓶中作为待测液。

1.2.3样品的测定

取待测液10 mL，添加1 mL亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，再加入1 mL硝酸铝溶液，摇匀，继续静置6 min后，加10 mL氢氧化钠溶液并用水定容至刻度，静置15 min，在波长500 nm处测定吸光度，同时，以不添加硝酸铝溶液配制空白液。

1.2.4样品处理工艺优化

研究提取溶剂浓度、超声时间、提取料液比对测定结果的影响，并选出最优的样品处理条件。

1.2.5测定方法的精密度、准确度分析

1.3计算公式

样品中总黄酮的含量（X）按下列公式计算：

式中：X为样品中总黄酮含量，mg/kg；A为由标准曲线所得总黄酮含量，μg/mL；M为样品量，g；V1为待测液的体积，mL；V2为配制测试液吸取的待测液体积，mL；V3为配制的测试液总体积，mL；

2　结果与分析

2.1乙醇浓度的选择

黄酮类化合物常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等。但由于甲醇、丙酮等的毒性较大，因此提取黄酮一般采取乙醇作为溶剂，乙醇的浓度在50%～100%之间。

称取20 g样品于锥形瓶，分别溶于50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液50 mL，超声处理15 min，在30℃下回旋振荡浸提10 h，静置过夜后过滤，滤液进行减压浓缩，浓缩液定容于25 mL容量瓶中作为待测液进行测定。测定结果如图1所示。

图1　不同乙醇浓度所得测试液Fig.1　The effect of ethanol concentration on detecting solution

测定结果表明：当乙醇浓度为50%～60%时，提取液过滤分离困难，且测试液为乳白色液体，无法通过分光光度法测定，原因可能是样品中含有一定量经处理的蛋白类成分，乙醇浓度较低时，乙醇溶液中的水分会将蛋白类成分提取出来，造成测试液不澄清透亮，因此，无法测得结果；当乙醇浓度为80%～100%时，测试液加入氢氧化钠后变为浊液，原因可能是植物提取物固体饮料成分复杂，含有葡萄糖、麦芽糊精、可溶性膳食纤维、蛋白质等多种成分，在含水量较低的碱性环境下，整个体系不稳定，可能发生了络合等现象，造成测试液为浊液，无法测定黄酮含量，具体原因有待进一步研究；在乙醇浓度为70%时，测试液为澄清溶液，可进行吸光度测定，因此选择乙醇浓度为70%。2.2超声时间的选择

植物提取物固体饮料成分复杂，不同产品制备过程迥异，这些原因均会影响总黄酮的溶出。超声波可产生的强烈振动、空化效应和搅拌等特殊作用，可加速有效成分的溶出，因此，对样品进行超声处理，可充分提取产品中总黄酮，提高测定的准确性。

称取20g样品于锥形瓶，溶于70%乙醇溶液50mL，分别超声处理15、20、25、30、35、40 min后，在30℃下回旋振荡浸提10 h，静置过夜后过滤，滤液进行减压浓缩，浓缩液定容于25 mL容量瓶中作为测试液进行测定。测定结果如图2所示。

图2　超声时间的选择Fig.2　The optimization of ultrasonic time

在超声时间15 min～30 min内，随着超声时间的延长，吸光值不断升高，在超声时间30 min～40 min范围内，吸光值趋于稳定，统计学上无显著性差异，因此可以选择超声时间为30 min。

2.3提取料液比的选择

称取20 g样品于锥形瓶，分别按料液比1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶7.5、1∶10（g/mL）溶于70%乙醇溶液中，超声处理30 min后，在30℃下回旋振荡浸提10 h，静置过夜后过滤，滤液进行减压浓缩，浓缩液定容于25 mL容量瓶中作为测试液进行测定。测定结果表明：当料液比为1∶1（g/mL）时，样品与溶剂无法充分接触，总黄酮无法充分溶于溶剂中；当料液比在1∶5（g/mL）～1∶10（g/mL）时，由于植物提取物固体饮料的主要成分是葡萄糖、麦芽糊精等低聚糖，随着料液比的提高，这些糖分的提取率亦不断升高，最后所得测试液中糖分含量升高，造成测试液粘稠且混浊，得到的吸光值不稳定，结果见表1；料液比为1∶2.5（g/mL）时，溶出的糖分量低，适宜测定，因此选择料液比为1∶2.5（g/mL）。

表1　不同料液比测试结果Table 1　The result of different ratio of solid to liquid

2.4芦丁标准曲线

芦丁标准曲线见图3。

图3　总黄酮测定标准曲线Fig.3　The standard curve of flavonoids determination

由于植物提取物固体饮料中总黄酮含量较低，而测试液中糖分含量很高，无法进行有效浓缩，因此须建立低范围的标准曲线，实验表明芦丁含量在低浓度0～20 μg/mL之间线性良好，符合朗伯-比尔定律，其回归方程为Y=0.012 7X-0.002 4，相关系数R=0.999 3。

2.5精密度试验

在优化的样品处理条件下，对5种不同植物提取物固体饮料样品进行测定，并计算相对标准偏差（RSD），结果见表2。

表2　精密度测定结果Table 2　The result of precision

该方法的RSD值在1.03%～7.83%范围内，精密度良好。

2.6准确度实验

在优化的处理条件下，制得待测液，然后向待测液中加入浓度为50 μg/mL的芦丁标准品溶液0.8、1.0、1.2 mL，测得结果见表3，该方法的平均回收率为98.44%。

表3　准确度测定结果Table 3　The result of recovery

2.7检出限

参照相关文献[17-18]，得到本法的检出限为1.0 μg/mL。

3　结论

本研究优化的含植物提取物固体饮料总黄酮测定方法为：精确称取一定量样品，置于锥形瓶中，按料液比1∶2.5（g/mL）加入70%稀乙醇溶液溶解，密封，超声处理30 min，在30℃下回旋振荡浸提10 h，静置过夜后过滤，滤液进行减压浓缩，浓缩液定容于25 mL容量瓶中作为待测液进行测定。

芦丁在低浓度0～20 μg/mL范围内，标准曲线线性方程为Y=0.012 7X-0.002 4，R=0.999 3，线性关系良好。本法测定总黄酮的相对标准偏差为1.03%～7.83%，平均回收率为98.44%。该方法简便、准确度较高，是测定固体饮料总黄酮较为理想的方法之一，能广泛应用于含植物提取物固体饮料的检测中。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.042

收稿日期：2014-04-12

作者简介：高丽霄（1985—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：健康食品。

*通信作者

Study on the Determination of Total Flavonoids in Solid Drink with Plant Extract

GAO Li-xiao，LIN Han-qing，LIU Mei-sen*，ZANG Cheng-guo
（Shenzhen Weicky Biotechnology Co.，Ltd.，Shenzhen 518109，Guangdong，China）

Abstract：A more applicable and accurate method was developed to determine the total flavonoids in solid drink with plant extract by spectrophotometric method in this study.The effects of the concentration of solvent，

ultrasonic time and ratio of solid to liquid on the determination of total flavonoids were studied.The standard curve in low rutin concentration and the precision and accuracy of that method were analyzed.The optimum conditions were as follow：the concentration of solvent was 70%ethanol，the ultrasonic time was 30 min and the ratio of solid to liquid was 1∶2.5（g/mL）.Under this condition，this method showed good linearity（Y=0.0127X-0.002 4，R=0.999 3）in low rutin concentration（0-20 μg/mL）and average recovery（98.44%）as well as low RSD（1.03%-7.83%）.This simple method was regarded to be very useful and high accuracy for the determination of total flavanoids in solid drink with plant extract.

Key words：total flavonoids；determination；spectrophotometric method；solid drink with plant extract