酶解胡麻籽粕蛋白制备抗氧化肽的工艺优化

董　聪，李　芳，王　琳，苏洪波，孔令明，*（.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐83005；.新疆轻工职业技术学院，新疆乌鲁木齐8300）

酶解胡麻籽粕蛋白制备抗氧化肽的工艺优化

董聪1，李芳2，王琳1，苏洪波1，孔令明1，*
（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.新疆轻工职业技术学院，新疆乌鲁木齐830021）

摘要：以胡麻籽粕蛋白粉为原料，分别采用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶及中性蛋白酶对胡麻籽粕蛋白进行酶解，以水解度为指标对酶制剂进行筛选。通过单因素及正交试验，以抗氧化性为指标，获取最佳酶解工艺。结果表明，碱性蛋白酶对胡麻籽粕蛋白的酶解效果较好，胡麻籽粕蛋白的最佳酶解工艺为：底物浓度1.5%，pH 8.5，酶底比3%，超声波功率300 W，酶解温度40℃、酶解时间3 h，在此条件下，胡麻籽粕多肽对O2-·和OH-·清除能力分别为42%和30%。

关键词：胡麻籽粕；酶解；多肽；抗氧化活性

胡麻籽为亚麻科植物亚麻Lium usitatissimum L的干燥成熟种子，是中国五大油料作物之一，中国历年种植面积约为60万hm2，种子产量约为25万t～30万t，主要产区是山西、甘肃、内蒙古、宁夏、河北、新疆等地。种子含脂肪油，油中主要成分为亚麻酸、亚油酸、油酸及少量饱和脂肪酸的甘油酯。此外，尚含黏液质、蛋白质等。经测定去油后的胡麻籽粕中含有16.7%的胡麻籽蛋白及8.53%的粗脂肪，而长期以来胡麻籽粕多被用于肥料和饲料，造成了其中所含的优质蛋白质资源的极大浪费。科学研究发现，将蛋白质进行酶解可获得许多具有多种生物活性的肽，其具有的生物活性包括抗氧化作用、抗病毒、抗高血压、激素调节、免疫调节等[1]。若使用胡麻籽粕为原料制备胡麻籽蛋白抗氧化活性肽，则极大地增加了产品的附加值，故研究酶解胡麻籽蛋白制备胡麻籽多肽的工艺具有重要意义。

本研究以抗氧化活性为指标，对超声波辅助胡麻籽粕蛋白的酶解工艺进行优化，从而提高胡麻籽粕多肽的抗氧化活性。研究成果将为胡麻综合利用及开发功能性食品提供科学数据和参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1材料与试剂

胡麻籽粕蛋白：新疆农业大学食药学院实验室自制；碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶：均为南宁宠博生物工程有限公司提供；其它试剂均为分析纯。

1.1.2仪器与设备

粉碎机：上海一恒科技有限公司；XB120A型分析天平：上海天平厂；PHS-3C雷磁：上海仪电科学仪器股份有限公司；全数字超声波发生器：武汉嘉鹏电子有限公司；电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；TD5A-WS台式低速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；TU-1810紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2试验方法

1.2.1蛋白酶活力测定

蛋白酶活力的测定采用福林—酚法[2]。

1.2.2粗蛋白含量测定

粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮法[3]。

1.2.3氨基氮含量的测定

氨基氮含量的测定采用甲醛滴定法[4]。

1.2.4水解度的测定[5]

水解度（DH）=样品中的氨基氮含量/样品中的总氮×100%

1.2.5蛋白质酶解工艺流程

胡麻籽粕蛋白→2%悬浮液→热变性处理→调pH→酶解→灭酶→离心→取上清液

1.2.6蛋白酶的筛选[6]

选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶在最适酶解条件下对胡麻籽粕蛋白进行酶解，以水解度为指标，筛选出的最适的酶制剂。

1.2.7抗氧化能力的测定

OH-·清除能力的测定—采用邻二氮菲-Fe2+氧化法[7]；O2-·清除能力的测定—采用邻苯三酚方法[8]。

1.2.8单因素试验

选定最佳蛋白酶后，以抗氧化性为指标，比较在酶解过程中pH、温度、酶解时间、底物浓度、超声波功率、酶底比对胡麻籽粕多肽抗氧化能力的影响。

1.2.9酶解工艺优化

在单因素试验的基础上，以抗氧化性为指标，选择A（底物浓度）、B（pH）、C（酶底比）、D（超声波功率）进行四因素三水平正交试验，因素水平见表1。

表1　试验因素水平设计Table 1　Factor level of experimental design

2　结果与分析

2.1蛋白酶活力

经测定，木瓜蛋白酶活力为10.1万U/g，碱性蛋白酶活力为13.6万U/g，中性蛋白酶36.6万U/g。

2.2粗蛋白含量

根据凯氏定氮法测得胡麻籽粕蛋白质中粗蛋白含量为74.5%。

2.3酶的筛选

经测定，木瓜蛋白酶水解度为15.65%，碱性蛋白酶水解度为17.28%，中性蛋白酶水解度为16.44%。

由测定结果可知，3种蛋白酶在其最适宜条件下对胡麻籽粕蛋白进行酶解，以碱性蛋白酶酶解效果较好，故选用碱性蛋白酶作为酶解胡麻籽粕蛋白的最适酶制剂。

2.4单因素试验结果分析

2.4.1pH对抗氧化能力的影响

在温度50℃、酶解时间2 h、底物浓度2%、超声波功率为400 W、酶底比为5%、pH分别为8、9、10、11的酶解条件下，测定抗氧化能力如图1所示。

图1　pH对胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影响Fig.1　Effect of pH on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由图1可知，当pH为9时，抗氧化能力达到最高值，pH继续增大，多肽对OH-·清除能力有所下降，对O2-·清除能力趋于平缓，即确定酶解反应的最适pH 为9。

2.4.2酶解温度对抗氧化能力的影响

在pH9、酶解时间2 h、底物浓度2%、超声波功率为400 W、酶底比为5%、温度分别为30、40、50、60℃的酶解条件下，测定抗氧化能力如图2所示。

由图2可知，当温度为40℃时，抗氧化能力达到最高值，温度继续增大，多肽对OH-·清除能力有所下降，对O2-·清除能力趋于平缓，即确定酶解反应的最适温度为40℃。

2.4.3酶解时间对抗氧化能力的影响

在pH9、温度50℃、底物浓度2%、超声波功率为400 W、酶底比为5%、酶解时间分别为1、2、3、4、5 h的酶解条件下，测定抗氧化能力如图3所示。

图2　温度对胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影响Fig.2　Effect of temperature on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

图3　时间对胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影响Fig.3　Effect of time on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由图3可知，当时间为3 h时，抗氧化能力达到最高值，时间继续增长，多肽对OH-·清除能力有所下降，对O2-·清除能力趋于平缓但不再增加，即确定酶解反应的最适时间为3 h。

2.4.4底物浓度对抗氧化能力的影响

在pH9、温度50℃、酶解时间2 h、超声波功率为400 W、酶底比为5%、底物浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%的酶解条件，测定抗氧化能力如图4所示。

图4　底物浓度对胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影响Fig.4　Effect of substrate concentration on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由图4可知，当底物浓度为2%时，抗氧化值达到最高，底物浓度继续增大，多肽对OH-·清除能力有所下降，对O2-·清除能力趋于平缓但呈下降趋势，即确定酶解反应的最适底物浓度为2%。

2.4.5超声波功率对抗氧化能力的影响

在pH9、温度50℃、酶解时间2 h、底物浓度2%、酶底比为5%、超声波功率分别为200、300、400、500、600 W的酶解条件，测定抗氧化能力如图5所示。

图5　超声波功率对胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影响Fig.5　Effect of ultrasonic power on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由图5可知，当超声波为300 W时，抗氧化值达到最高，超声波继续增大，多肽对OH-·清除能力有所下降，对O2-·清除能力随之减弱，即确定酶解反应的最适超声波功率为300 W。

2.4.6酶底比对抗氧化能力的影响

在pH9、温度50℃、酶解时间2 h、超声波功率为400W、底物浓度2%、酶底比分别为1%、3%、5%、7%、9%的酶解条件，测定抗氧化能力如图6所示。

图6　酶底比对胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影响Fig.6　Effect of enzyme substrate ratio on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由图6可知，当酶底比为3%时，抗氧化值达到最高，酶底比继续增大，多肽对OH-·清除能力有所下降，对O2-·清除能力随之减弱，即确定酶解反应的最适酶底比为3%。

2.5正交试验结果分析

通过以上单因素试验可知，pH、温度、时间、底物浓度、超声波功率、酶底比对胡麻籽粕蛋白酶解物的抗氧化性都有一定的影响，现以A（底物浓度）、B （pH）、C（酶底比）、D（超声波功率）进行正交试验。由正交试验得胡麻籽粕多肽酶解液的抗氧化性能结果如表2所示。

根据极差R大小，得出各因素影响OH-·清除能力的次序为：D（超声波功率）＞B（pH）＞C（酶底比）＞A（底物浓度），影响O2-·清除能力的次序为：C（酶底比）＞B（pH）＞D（超声波功率）＞A（底物浓度）。结果表明：胡麻籽蛋白抗氧化能力的最佳工艺参数为：A1B1C2D2，即底物浓度为1.5%，pH为8.5，酶底比为3%，超声波功率为300 W，此条件下多肽抗氧化能力最强。

对得出工艺参数进行验证试验，试验结果得出胡麻籽粕多肽对OH-·和O2-·的清除能力分别为42%和30%。与正交试验2号相比较有较大提高，说明正交试验得出的工艺参数可靠。

表2　胡麻籽粕多肽酶解液的抗氧化性能Table 2　Antioxidant properties of linseed meal peptide

3　结论

1）各因素影响OH-·清除能力的次序为：超声波功率＞pH＞酶底比＞底物浓度，影响O2-·清除能力的次序为：酶底比＞pH＞超声波功率＞底物浓度。

2）在碱性蛋白酶的作用下，胡麻籽粕蛋白的最佳酶解工艺为：底物浓度2%、pH 9.5、酶底比3%、超声波功率300 W、酶解温度40℃、酶解时间3 h。在此条件下，胡麻籽粕多肽对OH-·和O2-·的清除能力分别为42%和30%。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.028

基金项目：新疆维吾尔自治区优秀青年科技创新人才培养项目“超声联合超微粉碎生产胡麻籽蛋白粉的技术研究及产品开发”（2013721024）

收稿日期：2014-05-17

作者简介：董聪（1990—），女（汉），硕士研究生，研究方向：农产品加工及综合利用。

*通信作者

Optimization the Process of Enzymatic Linseed Meal Protein Preparation Anti-oxidation Peptide

DONG Cong1，LI Fang2，WANG Lin1，SU Hong-bo1，KONG Ling-ming1，*
（1.College of Food and pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Xinjiang，China；2.Xinjiang Institute of Light Industry Technology，Urumqi 830021，Xinjiang，China）

Abstract：Linseed meal protein powder was used as raw material.Papain，alcalase，neutral protease were used respectively to linseed meal protein on enzyme.Degree of hydrolysis as an indicator for screened the enzymes. Regard antioxidant activity as an indicator for optimal enzymatic processes by orthogonal.The results showed thatalcalase was optimal protease.The optimal enzymatic process of linseed meal protein：substrate concentration 2%，pH 9.5，enzyme-substrate ratio 3%，ultrasonic power 300 W，hydrolysis temperature 40℃，hydrolysis time 3 h，under this conditions，the effects of scavenging on O2-·and OH-·were 42%and 30%.

Key words：linseed meal；enzymatic；peptides；antioxidant activity