树莓叶中鞣花酸提取工艺的研究

刘　卉，杨国伟，兰蓉，马文志，林峰（北京电子科技职业学院，北京100029）

树莓叶中鞣花酸提取工艺的研究

刘卉，杨国伟*，兰蓉，马文志，林峰
（北京电子科技职业学院，北京100029）

摘要：研究树莓叶中鞣花酸的提取工艺，采用液相色谱法测定鞣花酸含量。设计以考察乙醇浓度，提取时间，提取温度，料液比为四因素三水平的正交试验。结果标明：影响鞣花酸提取率的先后顺序是：乙醇浓度→提取温度→提取时间→料液比；最佳提取工艺为乙醇浓度80%，提取时间60 min，提取温度95℃，料液比3∶140（g/mL）。

关键词：树莓；鞣花酸；提取工艺

树莓（raspberry）是蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（Rubus）多年生落叶性灌木型果树，又名马林、木莓、托盘等。树莓在国际市场上被誉为“黄金水果”[1]。在北温带、亚热带分布广泛。树莓是我国小浆果树种之一，其中以东北分布较多，华北、华东及华中地区也开始种植。树莓的果实、茎、根皆可入药，具有很高的药用价值，被称为生命之果。近年来研究发现，覆盆子（树莓）是世界上最好的花青素、SOD和鞣花酸来源之一[2]。树莓不仅被直接用于各类食品加工业，如果汁、果酱、果粉、果酒、糕点等，而且被开发运用于美容、香精、减肥、染料、医药等多种领域[3]。

树莓叶中含有多种功能性成分，主要包括酚类物质（花青素、鞣花酸和黄酮类等）、人参皂甙、抗坏血酸及微量元素等功能性成分[4-5]。现代医学研究发现，树莓中功效成分具有抗菌、抗癌、抗炎、抗氧化、保护肾功能、减肥和增强免疫力等多种生物学作用[6-7]。

鞣花酸是树莓中主要的酚类化合物，个别品种含量超过300 mg/kg。树莓中游离鞣花酸含量很低，主要是以鞣花单宁形式存在，经酸水解释放鞣花酸[8]。鞣花酸能抵抗多环芳香碳氢化合物、亚硝胺、毒枝菌素和黄曲霉素等多种化学致癌物质，能保护人体的贴体组织，增强身体功能。同时鞣花酸可解除草中与大豆的多环芳香烃，也可抵御熏肉与变霉花生中的致癌物质[9]。试验发现鞣花酸可导致癌细胞自体凋亡，却不影响正常细胞[10]。

有关鞣花酸的提取方法有盐酸法[11]、丙酮法[12]等。本试验以树莓叶为原料，以乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比为4因素，树莓中鞣花酸含量为指标，通过单因素和正交试验，确定树莓叶中鞣花酸的最佳提取工艺，为树莓鞣花酸的进一步利用提供试验基础和科学参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料与试剂

甲醇（色谱纯）：美国sigma；95%乙醇、无水乙醇（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；丙酮（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；浓盐酸（分析纯）：广州德树化工有限公司；冰乙酸（分析纯）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；无水碳酸钠、焦性没食子酸（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；三氯化铁、抗坏血酸（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；无水乙酸钠（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；TPTZ标准品（2，4，6-三吡啶基三嗪，HPLC≥99.0%）：广东翁江化学试剂有限公司；福林酚试剂（生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；鞣花酸标准品（HPLC≥98.0%）：上海源叶生物科技有限公司。

1.1.2主要仪器设备

ZKSY-6型一列六孔智能水浴锅：郑州长城科工贸有限公司；SHB-IV双A型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；C9860A型超声清洗仪：CBL Photoelectron Technology Co Ltd；CK15型高速冷冻离心机：美国Sigma公司；1100series型高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；CARY 50型紫外分光光度仪：美国瓦里安技术中国有限公司。

1.2方法

1.2.1鞣花酸的测定

1）鞣花酸的提取[13-14]

树莓叶片→烘干→粉碎→加热回流→滤膜过滤

取3 g树莓叶的干粉，过40目筛，加入试剂，回留提取，过滤后，残渣用提取溶剂20 mL洗涤，合并滤液和洗涤液，经0.45 μm滤膜滤过，即得。

2）色谱条件[15]

C18色谱柱（250 mm×4.5mm，5 μm）；柱温35℃；流动相为甲醇-水-冰乙酸（50∶49.85∶0.15，体积比），检测波长为254 nm；进样体积为10 μL；流速1．0 mL/min。

3）标准曲线制作

准确称取鞣花酸标准品40 mg，转移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到质量浓度均为400μg/mL的标准溶液。精密吸取对照品溶液2.5、5、10、15、20 μL进样，按上述色谱条件测定鞣花酸的峰面积。以鞣花酸含量为横坐标，峰面积为为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为y=8 745.1x-1 594.4，r=0.999 5。

4）鞣花酸含量计算[16]

式中：U为鞣花酸含量，%；C为提取液中鞣花酸浓度，μg/mL；V为提取液体积，mL；M为样品质量，g。

1.2.2鞣花酸提取的单因素试验

1）乙醇浓度对鞣花酸含量的影响：准确称取3 g树莓干粉，提取料液比3∶100（g/mL），时间为30 min，温度为80℃，提取一次，采用5个乙醇浓度（60%、70%、80%、90%、100%）提取鞣花酸。

2）温度对鞣花酸含量的影响：准确称取3 g树莓干粉，提取料液比3∶100（g/mL），时间为30 min，乙醇浓度80%，提取一次，采用5个温度（75、80、85、90、95℃）提取鞣花酸。

3）提取时间对鞣花酸含量的影响：准确称取3 g树莓干粉，提取料液比3∶100（g/mL），温度为95℃，乙醇浓度80%，提取一次，采用5个提取时间（15、30、45、60、75 min）提取鞣花酸。

4）料液比对鞣花酸含量的影响：准确称取3 g树莓干粉，时间为30 min，乙醇浓度80%，温度为95℃，提取一次，采用5个料液比3∶80、3∶100、3∶120、3∶140、3∶160（g/mL）提取鞣花酸。

1.2.3正交优化设计试验

在单因素试验基础上，为了综合考虑多因素相互作用对鞣花酸提取率的影响，根据单因素试验结果，采用L9（34）正交设计。

1.2.4重现性试验

在正交试验中选出最佳提取工艺，进行多次重复试验，取平均值，并对实验结果进行相对平均偏差和相对标准偏差分析，检测提取方法的重现性。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1乙醇浓度对鞣花酸含量的影响

乙醇浓度对鞣花酸含量的影响见图1。

图1　乙醇浓度对鞣花酸含量的影响Fig.1　Effect of ethanol concentration on the content of ellagic acid

乙醇浓度在90%时，鞣花酸含量最大；随着乙醇浓度的提高，少量鞣花酸在乙醇溶液中的溶解度下降析出，过滤、离心操作时沉淀下来，造成鞣花酸含量有一定量的减少。

2.1.2提取温度对鞣花酸含量的影响

提取温度对鞣花酸含量的影响见图2。

图2　乙醇浓度对鞣花酸含量的影响Fig.2　Effect of temperature on the content of ellagic acid

提取温度在95℃时，鞣花酸含量最大；随着提取浓度的提高，鞣花酸含量呈现下降趋势。

2.1.3提取时间对鞣花酸含量的影响

提取时间对鞣花酸含量的影响见图3。

图3　提取时间对鞣花酸含量的影响Fig.3　Effect of time on the content of ellagic acid

超声时间在90 min时，鞣花酸的含量最大。

2.1.4料液比对鞣花酸含量的影响

料液比对鞣花酸含量的影响见图4。

图4　料液比对多糖含量的影响Fig.4　Effect of solid to liquid rate on the content of ellagic acid

料液比在3∶140（g/mL）时，鞣花酸的含量最大。随着料液比增大，鞣花酸的含量逐渐下降。

2.2正交试验结果与分析

在单因素试验基础上，设计以乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比为四因素三水平的正交试验，因素水平见表1。正交试验结果见表2。

表1　正交因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test

表2　正交试验结果与分析Table 2　The result of orthogonal experimental test

由表2可知，影响鞣花酸提取工艺的主次顺序为乙醇浓度→提取温度→提取时间→料液比，最佳提取工艺为A1B2C2D2，即乙醇浓度80%，提取时间60 min，提取温度95℃，料液比3∶140（g/mL），在此组合下，鞣花酸的含量达到0.4328 mg。

2.3稳定性试验

精密吸取供试品溶液，按上述色谱条件鞣花酸含量3次，计算测得RSD为1.36%，表明样品在8 h内稳定。

3　结论

本研究表明，影响鞣花酸提取效率的主次因素分别为：乙醇浓度→提取温度→提取时间→料液比，最佳提取工艺为A1B2C2D2，即乙醇浓度80%，提取时间60 min，提取温度95℃，料液比3∶140（g/mL），在此组合下，样品中鞣花酸的含量最高。

参考文献：

[1]杨婷婷.树莓的研究现状及开发利用[J].四川林业科技,2013,34 (3):29-32

[2] 高玉李,辛秀兰.树莓功能性成分及提取方法的研究进展[J].食品工业科技,2011,32(7):451-454

[3]张海军,王彦辉,张清华,等.国内外树莓产业发展现状研究[J].林业实用技术,2010(10):54-56

[4]黎庆涛,王远辉,王丽.树莓功能因子研究进展[J].中国食品添加剂,2011(2):172-177

[5]张琦,刘学,孟宪军,等.树莓叶的主要功效成分及开发利用前景[J].中国调味品,2008(2):26-29,44

[6] 孙红艳,孟军,吕安坤.国内外树莓体内研究现状[J].现在中西医结合,2014,23(18):2038-2041

[7]RYANT,WILKINSONJ M,CAVANAGH HM.Antibacterial activity of raspberry cordial in vitro[J].Res in Vet Sci,2001,7:1-5

[8]MullenW illiam,YokotaTakao,Lean E,et al.Analysis ofel-lagitannins and conjugates of ellagic acid and quercetin in rasp-berry fruits by LC-MSn[J].Phytochemistry,2003,64(2):617-624

[9]陈永存.覆盆子的营养功效及产品开发[J].农业工程技术(农产品加工),2007(10):41-43

[10]李小萍,梁琪,辛秀兰,等.红树莓果中鞣花酸提取物的抗氧化性研究[J].食品科技,2010,35(5):182-185

[11]李海霞,王彩芳,张红岭,等.石榴皮中鞣花酸的提取工艺研究[J].中国医药导报,2008,5(24):50-52

[12]李小萍,辛秀兰,刘亚红,等.红树莓果实中鞣花酸的提取工艺研究[J].食品工业科技,2010,31(1):277-279

[13]梁先长,李加兴,黄寿恩,等.火棘籽油提取工艺优化[J].食品与机械,2009,25(6):93-95

[14]胡园园,方淑玲,杨虎清,等.微波辅助提取山茱萸多糖工艺优化[J].食品与机械,2011,27(5):93-95

[15]刘玉革,王松标,刘胜辉,等.高效液相色谱法测定芒果果皮中游离鞣花酸含量[J].广东农业科学2011(18):128-129

[16]饶夙,陈祥贵,刘振平,等.鞣花酸和石榴皮多酚提取物抗氧化活性的比较[J].食品工业科学,2012,33(12):111-117

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.014

收稿日期：2015-04-19

基金项目：北京电子科技职业学院重点课题（编号：YZK2013021）

作者简介：刘卉（1967—），女（汉），副教授，本科，研究方向：食品药品抗氧化研究。

*通信作者

Study on the Extraction Technology of Ellagic Acid in Raspberry Leaf

LIU Hui，YANG Guo-wei*，LAN Rong，MA Wen-zhi，LIN Feng
（Beijing Polytechnic，Beijing 100029，China）

Abstract：In order to study the extract technology of ellagic acid from raspberry leaves.The content of ellagic acid was detected by HPLC.Three levels of the factors including ethanol concentration，extraction time，extraction temperature，material-liquid ratio were selected for the design.The orthogonal experiment showed that the order of factors which affected the content of ellagic acid was ethanol concentration＞extraction temperature＞extraction time＞material-liquid ratio.The optimum conditions for the extraction rate were as follows：ethanol concentration 80%，Extraction time 60 min，Extraction temperature 95℃，material-liquid ratio 3∶140（g/mL）.

Key words：raspberry；ellagic acid；extraction technology