维生素D受体基因BsmⅠ多态性与新疆维吾尔族、汉族儿童急性白血病的相关性研究*

王珍珍，王学梅，严媚，刘玉

（新疆医科大学第一附属医院儿科，新疆乌鲁木齐830054）

·临床论著·

维生素D受体基因BsmⅠ多态性与新疆维吾尔族、汉族儿童急性白血病的相关性研究*

王珍珍，王学梅，严媚，刘玉

（新疆医科大学第一附属医院儿科，新疆乌鲁木齐830054）

目的探讨维生素D受体（VDR）基因BsmⅠ位点单核苷酸多态性与新疆维吾尔族、汉族儿童急性白血病（AL）的相关性。方法以新疆医科大学第一附属医院儿科150例急性白血病患者（维吾尔族83例，汉族67例）及161例（维吾尔族75例，汉族86例）同期健康体检儿童为研究对象，用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）检测VDR基因BsmⅠ多态性分布。结果①白血病患儿与对照组的BsmⅠ基因型、等位基因分布比较，差异有统计学意义（χ2=9.326和5.983，P=0.009和0.014）；②对于维吾尔族儿童，病例组与对照组的BsmⅠ基因型（GG+GA/AA）、等位基因分布比较，差异无统计学意义（χ2=1.296和1.027，P=0.255和0.311）；而对于汉族儿童，病例组与对照组的BsmⅠ基因型（GG+GA/AA）、等位基因分布比较，差异有统计学意义（χ2=10.414和6.661，P=0.001和0.010）。③就白血病患儿而言，维吾尔族与汉族的BsmⅠ基因型、等位基因分布比较，差异无统计学意义（χ2=7.797和2.518，P=0.180和0.113）；对照组中维吾尔族与汉族的BsmⅠ基因型、等位基因分布差比较，差异无统计学意义（χ2=0.650和0.000，P=0.420和0.993）。结论白血病患儿与非白血病患儿VDR基因BsmⅠ的多态性分布区别不大，BsmⅠ的多态性分布与白血病有相关性。其中BsmⅠ基因分布与汉族儿童白血病有相关性，而与维吾尔族儿童白血病无关。无论在白血病患儿或正常儿童，BsmⅠ基因型分布都不存在民族差异。

维生素D受体基因；儿童；白血病；维吾尔族；汉族

急性白血病（acute leukemia，AL）是一组高度异质性的造血干细胞恶性、克隆性疾病，是儿童时期最常见的恶性肿瘤，居儿童恶性肿瘤死亡率的首位，严重威害儿童的健康[1-2]。白血病的发病机制非常复杂，分子生物学研究证明AL的本质是多基因异常引起的恶性肿瘤，涉及许多癌基因的激活和/或抑癌基因的失活，是一个多步骤的过程[3-4]，近十几年来，人们先后在多种白血病细胞系中发现维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）的表达。VDR在多种白血病细胞的表达使学者们认为白血病细胞是维生素D和VDR作用的靶细胞，VDR基因可能是白血病的易感基因[5]。VDR基因与急性白血病的相关性开始受到关注，但研究较少且结论不一致。本研究采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）方法，对新疆维吾尔族、汉族VDR基因BsmⅠ位点多态性与急性白血病的相关性进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1研究对象

选取2013年09月-2015年1月新疆医科大学第一附属医院儿科经细胞形态学、免疫学、细胞遗传学及分子生物学（morphology immunology cytogenetics molecular，MICM）分型确诊的150例儿童为病例组，在知情同意的原则下选取同期在儿科预防保健门诊体检的161例非白血病儿童为对照组。排除合并其他恶性肿瘤及其他严重心、脑、肾疾病的患儿；年龄28 d～14岁，平均（3.56±0.58）岁，个体间无血缘关系。

1.2方法

1.2.1 仪器与试剂全血提取DNA试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供，PCR正、反向引物由上海生工生物工程技术服务有限公司生产，限制性内切酶由美国MBI公司生产，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix及100 bp DNA Ladder Marker、10×TBE电泳缓冲液由大连宝生生物工程有限公司生产，琼脂糖和溴化乙锭分别由法国Biowest agre公司和美国Sigma公司生产。

1.2.2 DNA提取晨起空腹采集新鲜静脉血1～2ml，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，进行DNA提取。

1.2.3 PCR扩增和DNA测序①引物序列：通过美国国家生物信息中心（National Center of Biology Information，NCBI）的Gene Bank获取VDR基因序列及BsmⅠ位点的单核苷酸多态性信息，利用Primer 5.0软件设计引物序列。BsmⅠ正向引物：5'-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3'，BsmⅠ反向引物：5'-AACCAGCGGGAAGAGGTCAAG GG-3'，②PCR扩增：PCR反应体系包括DNA模板0.2μg，正、反向引物各0.2μl，Premix Taq 10μl，灭菌双蒸水补足反应总体积至20μl。PCR扩增反应条件如下：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸5 min，共30个循环，72℃继续延伸5 min。③PCR-RFLP分析：取PCR产物10μl，加入0.2μl相应的限制性内切酶及缓冲液，恒温37℃水浴箱中酶切90 min。酶切产物于2％琼脂糖凝胶上电泳30 min，用凝胶图像分析系统分析基因型。④随机抽取经PCR-RFLP确定的不同基因型的PCR产物各两例送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果用Chromas软件读出后与Gene Bank序列进行对比。

1.2.4 质量控制①所有调查人员经过系统培训；②实验在盲法下进行；③随机抽取10％标本行重复性实验，监测基因型与之前结果完全一致。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料以率表示，Hardy-Weinberg遗传平衡和不同组的基因型分布、等位基因频率比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1基因型的PCR-RFLP分析

BsmⅠ可分别得到3种基因型：①等位基因无酶切位点的纯合子出现203bp 1条带，表示为AA；②只有1个酶切位点的杂合子出现461、258和203 bp 3条带，表示为GA；③有两个酶切位点的纯合子出现258和203 bp两条带，表示为GG。见图1。

图1 VDR-PCR产物经BsmⅠ酶切后的电泳图

2.2Hardy-Weinberg遗传平衡检验

将对照组中汉族及维吾尔族儿童的BsmⅠ基因位点的实际频数与理论频数进行χ2检验，结果显示，差异无统计学意义，表明BsmⅠ基因位点分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡（χ2=1.171和0.980，P=0.560和1.000）。见表1。

2.3病例组和对照组BsmⅠ基因型及等位基因的分布特点

白血病与非白血病患儿3种BsmⅠ基因型分布比较，差异有统计学意义（χ2=9.326，P=0.009）；等位基因分布比较差异有统计学意义（χ2=5.983，P=0.014）。见表2。

2.4不同民族病例组和对照组BsmⅠ基因型的分布特点

汉族病例组与对照组GG+GA/AA基因型、等位基因分布比较，差异有统计学意义（χ2=10.414和6.661，P=0.001和0.010）；维吾尔族病例组与对照组GG+GA/AA基因型、等位基因分布比较，差异无统计学意义（χ2=1.296和1.027，P=0.255和0.311）。见表3。

2.5病例组和对照组不同民族BsmⅠ基因位点多态性的分布特点

病例组中汉族与维吾尔族GG+GA/AA基因型、等位基因分布比较，差异无统计学意义（χ2=7.797和2.518，P=0.180和0.113）；对照组中BsmⅠ基因分布比较，差异无统计学意义（χ2=0.650和0.000，P=0.420和0.993）。见表4。

表1 对照组汉族及维吾尔族儿童维生素D受体BsmⅠ基因位点的Hardy-Weinberg遗传平衡检验

表2 病例组和对照组BsmⅠ基因多态性及等位基因的分布比较例（％）

表3 不同民族病例组和对照组BsmⅠ基因多态性的分布比较

表4 病例组和对照组不同民族BsmⅠ基因位点的分布比较

3 讨论

维生素D是脂溶性维生素，对人类健康特别是儿童健康具有重要意义。VDR能在全身多个系统器官组织中表达，并具有多种功能，如调节激素分泌、影响免疫功能、调节细胞增生与分化等[6]。人体内几乎所有组织细胞及肿瘤细胞均有VDR存在，这可能是维生素D及其类似物影响多种肿瘤细胞的原因之一[7]。最近较多国内外研究发现，维生素D还能调节多种正常或肿瘤组织细胞的生长和分化，该作用是通过维生素D3受体介导[8-9]。目前研究表明，VDR与多种肿瘤有相关性。刘静波等[10]研究显示，VDR基因BsmⅠ位点多态性与肺腺癌发病风险有相关性，BsmⅠ位点B等位基因可能增加肺腺癌的发病风险。有研究显示，VDR基因多态性与乳腺癌存在一定的相关性[11]。国外研究显示，中国汉族人群与欧洲人种BsmⅠ基因多态性位点分布比较。差异有统计学意义[12]。宁夏回族自治区的一项研究显示，汉族与回族BsmⅠ基因多态分性分布比较。差异有统计学意义，因此维生素D受体基因多态性可能存在民族差异。

本研究通过对汉维族的白血病患儿、非白血患儿的BsmⅠ不同基因型进行检测，以证实不同基因型VDR在维、汉患儿白血病发生中的重要作用。本研究结果表明，白血病及非白血病患儿BsmⅠ基因型、等位基因分布比较，差异有统计学意义，提示白血病的发生与BsmⅠ有相关性，与郑敏等[13]在广西汉族白血病患儿维生素D受体基因多态性的研究结果不同。MANCHANDA等[14]研究结果表明，病例组与对照组BsmⅠ位点多态性分布比较差异无统计学意义，提示VDR基因BsmⅠ酶切位点的多态性可能与儿童白血病的遗传易感性无关。但国外研究显示，病例组与对照组BsmⅠ位点多态性分布比较，差异有统计学意义[14]，与新疆地区的白血病基因分布相似。本研究加入民族因素，将汉族及维吾尔族的病例组及对照组分别进行分析，汉族的白血病患儿与对照组的BsmⅠ基因型分布、等位基因分布比较，差异有统计学意义，但维吾尔族儿童的分析结果与其相反，并且无论在病例组还是对照组中，汉族与维吾尔族的上述基因分布比较差异无统计学意义，与国外ZHANG等[12]研究结果不同。但上述研究并未涉及汉族与维吾尔族的比较，其初步结论提示维、汉患儿的BsmⅠ基因型分布无明显区别。不同地区、不同人种的遗传因素可能不同。环境因素的差异，以及环境及遗传因素的相互作用使基因型分布更复杂。本研究仅限于在新疆医科大学第一附属医院就诊的儿童，样本量受限，有待进一步研究。

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（童颖丹 编辑）

Association of vitamin D receptor geneBsmⅠpolymorphism in Han and Uighur children with acute leukemia*

Zhen-zhen WANG,Xue-mei WANG,Mei YAN,Yu LIU
(Department of Pediatrics,the First Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University,Urumqi,Xinjiang 830054,P.R.China)

【Objective】To investigate the relationship between vitamin D receptor(VDR)geneBsmⅠpolymorphism and hereditary susceptibility of Han and Uighur children with acute leukemia.【Methods】The VDR geneBsmⅠwas detected in 150 children with acute leukemia(83 Uighur and 67 Han)and 161 healthy controls(75 Uighur and 86 Han)using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method.【Results】①There were statistically significant differences in frequencies ofBsmⅠgenotype and the alleles between the acute leukemia cases and healthy controls(χ2=9.326 and 5.983,P=0.009 and 0.014).②There was no significant difference in frequencies ofBsmⅠgenotype(GG+GA/AA)or the alleles between the acute leukemia cases and healthy controls of Uighur children(χ2=1.296,1.027;P=0.255,0.311),while there were statistically significant differences in frequencies ofBsmⅠgenotype(GG+GA/AA)and the alleles between the acute leukemia cases and healthy controls of Han children(χ2=10.414 and 6.661,P=0.001 and 0.010).③There was no significant difference in frequencies ofBsmⅠgenotype or the alleles of either acute leukemia cases(χ2=7.797,2.518;P=0.180,0.113)or healthy controls(χ2=0.650,and 0.000;P=0.420 and 0.993)between the Han and Uighur children.【Conclusions】Polymorphism distribution of VDR geneBsmⅠis associated with acute leukemia of Han children,but not associated with acute leukemia of Uighur children.BsmⅠis not associated with ethic difference.

vitamin D receptor gene;child;acute leukemia;Uighur;Han

R733.7

A

1005-8982（2015）35-0058-04

2015-10-20

新疆医科大学第一附属医院科研项目（No：2012QN04）

严媚，E-mail：yan10mei25@163.com；Tel：13669901666