神经肽受体1表达在胃癌临床病理中的意义及其与β-catenin、表皮生长因子受体的相关性

黄丹丹，虞敏红，蔡颖，杨树东，孙荣超，陈瑛，周志毅

（南京医科大学附属无锡人民医院1.消化内镜中心，2.病理科，江苏无锡214023）

·论著·

神经肽受体1表达在胃癌临床病理中的意义及其与β-catenin、表皮生长因子受体的相关性

黄丹丹1，虞敏红2，蔡颖2，杨树东2，孙荣超2，陈瑛2，周志毅2

（南京医科大学附属无锡人民医院1.消化内镜中心，2.病理科，江苏无锡214023）

目的探讨神经肽受体1（NTR1）表达在胃癌（GC）临床病理中的意义及其与β-catenin和表皮生长因子受体（EGFR）的相关性。方法用免疫组织化学Envision二步法检测210例手术治疗GC患者癌组织和癌旁组织中NTR1、β-catenin及EGFR表达，分析NTR1与临床病理参数、β-catenin和EGFR的相关性。结果①GC中NTR1表达明显高于癌旁正常胃组织；②NTR1高表达与GC的组织分级、T分期、TNM分期及淋巴结转移密切相关；③NTR1与β-catenin核异常表达呈正相关，而与EGFR表达无关；④生存分析显示，NTR1高表达、高组织分级、弥漫型及高TNM分期患者的预后较差；经Cox多因素分析显示，NTR1高表达及TNM分期是独立预后因素。结论GC NTR1高表达提示患者预后差；NTR1基因功能可能参与GC的发生、发展，可作为潜在的预后指标及分子治疗靶点。NTR1与β-catenin的协同作用可能参与GC的发生、发展，而NTR1与EGFR的相关性尚不明确，有待进一步研究。

胃癌；神经肽受体1；临床病理；预后；β-catenin；表皮生长因子受体

胃癌（gastric cancer，GC）是一种很常见的恶性肿瘤[1]。我国胃癌的发生率位居第3位，复发和转移是胃癌5年生存率低的重要原因，其复杂的分子机制有待阐明[2]。目前，GC的预后仍依靠传统的病理学指标，如肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移及远处转移，需要寻找一个敏感而特异的早期预后指标。

近年来研究发现，神经降压素（Neurotensin，NT）与其高亲合力神经肽受体1（neurotensin receptor 1，NTR1）在肿瘤发生、发展中常出现异常调控。NT是一种多肽，常分布于胃肠道中，通过与其受体结合产生作用，NTR包括3个类型，即NTR1、2及3，NT主要通过NTR1发挥调控作用[3-4]。研究发现，NTR1涉及多种肿瘤的发生、发展，如胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌及头颈部癌[5-6]。NTR1基因可通过多种信号通路导致细胞生长、迁移及侵袭，有研究发现，NTR1可通过表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号促进多种恶性肿瘤的生长[7]。另外，有文献显示，β-catenin致癌信号通路可通过调控NTR1基因促进细胞的生长和转化[8]。

目前，尚无NTR1表达在胃癌临床病理中的意义及其与β-catenin和EGFR的相关性研究。本实验通过免疫组织化学法检测NTR1、β-catenin及EGFR在胃癌中的表达，探讨NTR1与胃癌临床病理、预后的相关性及应用价值，以及与β-catenin、EGFR的相关性。

1 资料与方法

1.1临床资料

选取2011年1月-2011年12月在南京医科大学附属无锡人民医院经手术切除的侵犯黏膜下层或更深层次胃腺癌患者的病理科存档资料，所有患者手术前后未行放化疗，共210例。其中男性160例，女性50例，男女比为3.2∶1.0；年龄34～90岁，中位年龄64岁。病理学分级：高、中分化93例（44.3％），低分化117例（55.7％）；TNM分期：T1、T2期51例（24.3％），T3、T4期159例（75.7％）；有淋巴结转移者157例（74.8％），无淋巴结转移者53例（25.2％）；Ⅰ、Ⅱ期63例（30.0％），Ⅲ、Ⅳ期147例（70.0％）。癌旁正常胃组织作对照组。

1.2方法

石蜡包埋组织4μm切片，分别进行苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）和免疫组织化学法染色。一抗采用NTR1（多抗，使用浓度5μg/ml）购于美国Abcam公司，β-catenin（单抗，MAB-259）及EGFR（单抗，RMA-0554）购于福州迈新生物技术有限公司。采用Envision二步法，二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色。NTR1及EGFR定位于胞浆，β-catenin定位于胞膜、胞浆或胞核。NTR1按瘤细胞阳性率计分：阳性细胞＜10％为阴性（-），≥10％且＜50％为阳性（+），≥50％为强阳性（++）[9]。β-catenin正常表达定位于细胞膜，半定量评估癌细胞的核转位，将癌细胞核阳性染色比例分为：0％为0分；0％～5％为1分；5％～25％为2分；＞25％为3分，核阳性染色比例＞5％或＞2分视为存在癌细胞核转位或核异常表达[10]。EGFR染色行半定量评分，0、+、++和+++，+～+++视为阳性[11-12]。

1.3随访

采用病历跟踪和电话随访。随访时间最长42个月，最短2个月，平均28.5个月。随访时间截止2014年6月30日。

1.4统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析，组间比较用χ2检验或Fisher精确法，相关性检测用Spearman分析，生存差别比较用Kaplan-Meier法及Log-Rank检验，Cox模型进行多因素分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1NTR1在胃癌和癌旁组织中的表达

210例GC中149例（71.0％）NTR1阳性，而癌旁正常胃组织仅有28例（13.3％）NTR1阳性，癌组织NTR1表达上调，差异有统计学意义（P=0.000）。

2.2胃癌组织中NTR1表达与临床病理的相关性

NTR1高表达与组织分级、T分期、TNM分期及淋巴结转移密切相关，而与性别、年龄、肿块大小及Lauren分类无关。见图1、2和表1。

2.3NTR1与β-catenin核异常表达及EGFR的相关性

经免疫组织化学法检测，210例胃癌有53例（25.2％）同时存在NTR1阳性与β-catenin核异常表达，两者显著相关（见图3、4），而NTR1阳性表达与EGFR表达无关（P=0.050），见表2。

2.4NTR1表达与胃癌预后的相关性

图1 NTR1在胃癌组织中的表达（Envision法×200）

图2 NTR1在弥漫型胃癌组织中的表达（Envision法×200）

图3 肠型胃癌同一区域同时发生NTR1阳性与β-catenin核异常表达（Envision法×200）

表1 临床病理特征与NTR1表达的相关性

图4 同一弥漫型胃癌患者同时发生NTR1表达阳性与β-catenin核异常表达（Envision法×200）

210例胃癌患者随访1年及3年的生存率分别为78.9％和68.0％，经Log-rank检验，NTR1高表达、低分化癌组织、弥漫型Lauren分类、高T分期、有淋巴结转移及高临床分期预后较差，差异有统计学意义（P=0.000、0.014、0.004、0.026、0.000和0.000）。经Cox模型多因素分析，NTR1高表达及淋巴结转移是独立预后因素（B=0.444和3.097，P=0.017和0.006）。见图5和表3。

表2 β-catenin核异常、EGFR表达与NTR1表达的相关性

图5 胃癌患者NTR1生存分析

表3 胃癌预后Cox模型多因素分析

3 讨论

NT及NTR1对多种恶性肿瘤发生、发展及预后的作用日益受到学者的关注，NT的致癌作用主要通过高亲合力NTR1实现[5，13]。在炎症鼠模型发生的散发性癌中，NTR1表达与肿块的数目呈正相关[14]。VIAS等[15]发现，雄激素依赖性LNCaP细胞经长期抗雄激素处理后NT及NTR1表达上调，导致细胞增殖指数升高、细胞周期加快及侵袭性增强；在雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞系中，NTR1也明显高表达。胰腺癌存在特异性NT结合位点，而在正常胰腺及慢性胰腺炎组织中则没有，且80％胰腺癌表达高NSR1和NT[16]。结肠腺瘤及腺癌显示，NTR1中或强表达，且腺癌NTR1表达强于腺瘤，因此NTR1表达上调可能是结肠癌致癌过程中的早期事件[17]。本实验经免疫组织化学法检测发现，71％的胃癌组织中NTR1表达上调，并且与临床病理及预后密切相关。因此，笔者推测胃癌的发病机制可能涉及NTR1的高表达。

NTR1表达上调可促进肿瘤的进展和侵袭性，可作为一种预后指标[13]。在胰腺癌中，进展期或晚期患者的NTR1 mRNA水平高于早期[18]。在肺腺癌中，NTR1是一种独立性、负性预后因子，NTR1表达与较低的5年总生存率及无病生存期相关[9]。在乳腺浸润性癌中，NTR1高表达与SBR分级、肿块大小及淋巴结转移相关，是一种独立的病死率相关预后指标[19]。在头颈部鳞癌中，高水平NT、NTR1 mRNA与高发远处转移及低生存率显著相关[6]。在恶性胸膜间皮瘤中，高达90.4％的患者高表达NTR1，NT高表达与较差的预后相关[20]。在结肠癌中，NTR1表达强度与T分期呈正相关。在一些患者中，肿瘤浸润边际及脉管内癌细胞的NTR1表达高于肿块的主体部分[17]。本实验中胃癌的NTR1表达与组织分级、淋巴结转移及TNM临床分期呈正相关。多因素分析显示，NTR1高表达及高临床分期是独立的预后因素。笔者认为，NTR1可作为胃癌的一项潜在预后指标，其高表达预示胃癌进展及预后较差。淋巴结转移是一项可靠的预后指标，但癌细胞存在跳跃性转移，且淋巴结微转移只位于单独淋巴结一、二张连续切片内，传统常规病理检查极易漏诊，而临床分期的预后意义较滞后。因此，胃癌NTR1高表达时，即使没发现淋巴结转移也应引起临床重视。

近年来研究发现，多种癌细胞系存在经NT/NTR1复合体激活EGFR的现象。在前列腺癌PC3细胞系中，NT可通过激活蛋白激酶C-磷脂酰肌醇3激酶系统（protein kinase C-phosphatidylinositol 3 kinase system，PKC-PI3K）依赖性EGFR促进细胞生长[21]。NT也可通过基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）诱导Tyr845 EGFR磷酸化，进而激活EGFR，促进细胞的有丝分裂[22]。在结肠癌HT-29及HCT116细胞系中，亦存在NT/NTR1诱导EGFR激活，但两者的具体机制不同[23]。然而MASSA等[24]研究发现，在上述两种肠上皮细胞系中，NT和EGF都可促进肠上皮细胞的生长，但彼此的信号通路并不相互依赖。OLSZEWSKI-HAMILTON等[25]发现，在胰腺癌中NTR1和EGFR表达与细胞密度及细胞外pH有关，认为在胰腺癌初期生长中，EGFR可能起重要作用；在癌细胞转移扩散中，EGFR的作用逐步被其他生长因子受体替代，如NTR1。因此，在促细胞生长过程中，NT与EGF信号的关系很复杂。在本实验的胃腺癌患者中，NTR1阳性表达与EGFR表达无关，这可能是因为在各种胃腺癌类型中NTR1与EGFR的相关性存在差异，这需要细胞基因技术的进一步证实。

近年来研究发现，在肠腺瘤中，β-catenin的累积可诱导NTR1基因表达，说明NTR1高表达是肠癌发生的早期事件[8]。NTR1基因的调控区存在T细胞因子TCF结合位点，说明NTR1与APC/β-catenin信号相关。在炎症性肠病的致癌过程中，BOSSARD等[26]发现有两条促NTR1表达的通路，分别为NT高表达和β-catenin核累积，且两者相互依存。在肺癌、前列腺癌及乳腺癌中也存在相似的现象[27-28]。本实验的胃癌患者中，NTR1表达与β-catenin核转位也呈正相关，说明NTR1与β-catenin的协同作用可能参与胃癌的发生、发展，但到底是β-catenin信号上调NTR1表达，还是NTR1高表达激活β-catenin信号，尚不清楚。

综上所述，本实验通过免疫组织化学法检测发现NTR1基因与胃癌相关，NTR1高表达显示预后较差，提示NTR1与胃癌的发生及侵袭扩散有关。NTR1可作为胃癌的一种潜在预后指标及生物治疗分子靶点。NTR1与β-catenin的协同作用可能参与胃癌的发生、发展，而NTR1与EGFR的关系尚不明确，有待进一步研究。

[1]BLUM MA,TAKASHI T,SUZUKI A,et al.Management of localized gastric cancer[J].J Surg Oncol,2013,107(3)∶265-270.

[2]LIN Y,UEDA J,KIKUCHI S,et al.Comparative epidemiology of gastric cancer between Japan and China[J].World J Gastroenterol,2011,17(39)∶4421-4428.

[3]VITA N,LAURENT P,LEFORT S,et al.Cloning and expression of a complementary DNA encoding a high affinity human neurotensin receptor[J].FEBS Lett,1993,317(1/2)∶139-142.

[4]MARTIN S,NAVARRO V,VINCENT JP,et al.Neurotensin receptor-1 and 3 complex modulates the cellular signaling of neurotensin in the HT29 cell line[J].Gastroenterology,2002,123(4)∶1135-1143.

[5]THOMAS RP,HELLMICH MR,TOWNSEND CM,et al.Role of gastrointestinal hormones in the proliferation of normal and neoplastic tissues[J].Endocr Rev,2003,24(5)∶571-599.

[6]SHIMIZU S,TSUKADA J,SUGIMOTO T,et al.Identification of a novel therapeutic target for head and neck squamous cell carcinomas∶a role for the neurotensin-neurotensin receptor 1 oncogenic signaling pathway[J].Int J Cancer,2008,123(8)∶1816-1823.

[7]MOODY TW,CHAN DC,MANTEY SA,et al.SR48692 inhibits non-small cell lung cancer proliferation in an EGF receptor-dependent manner[J].Life Sci,2014,100(1)∶25-34.

[8]SOUAZ É F,VIARDOT-FOUCAULT V,ROULLET N,et al.Neurotensin receptor 1 gene activation by the Tcf/beta-catenin pathway is an early event in human colonic adenomas[J].Carcinogenesis,2006,27(4)∶708-716.

[9]ALIFANO M,SOUAZÉ F,DUPOUY S,et al.Neurotensin receptor 1 determines the outcome of non-small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res,2010,16(17)∶4401-4410.

[10]AUST DE,TERDIMAN JP,WILLENBUCHER RF,et al.Altereddistributionofbeta-catenin,anditsbindingproteins E-cadherinandAPC,inulcerativecolitis-relatedcolorectal cancers[J].Mod Pathol,2001,14(1)∶29-39.

[11]KIM MA,LEE HS,LEE HE,et al.EGFR in gastric carcinomas∶prognostic significance of protein overexpression and high gene copy number[J].Histopathology,2008,52(6)∶738-746.

[12]ATMACA A,WERNER D,PAULIGK C,et al.The prognostic impactofepidermalgrowthfactorreceptorinpatientswith metastatic gastric cancer[J].BMC Cancer,2012,12∶524.

[13]DUPOUY S,MOURRA N,DOAN VK,et al.The potential use of the neurotensin high affinity receptor 1 as a biomarker for cancer progression and as a component of personalized medicine in selective cancers[J].Biochimie,2011,93(9)∶1369-1378.

[14]BUGNI JM,RABADI LA,JUBBAL K,et al.The neurotensin receptor-1 promotes tumor development in a sporadic but not an inflammation-associated mouse model of colon cancer[J].Int J Cancer,2012,130(8)∶1798-1805.

[15]VIAS M,BURTT G,CULIG Z,et al.A role for neurotensin in bicalutamide resistant prostate cancer cells[J].Prostate,2007,67(2)∶190-202.

[16]WANG JG,LI NN,LI HN,et al.Pancreatic cancer bears overexpression of neurotensin and neurotensin receptor subtype-1 and SR 48692 counteracts neurotensin induced cell proliferation in human pancreatic ductal carcinoma cell line PANC-1[J].Neuropeptides,2011,45(2)∶151-156.

[17]GUIX,GUZMAN G,DOBNER PR,et al.Increased neurotensinreceptor-1expressionduringprogressionofcolonic adenocarcinoma[J].Peptides,2008,29(9)∶1609-1615.

[18]WANG L,FRIESS H,ZHU Z,et al.Neurotensin receptor-1 mRNA analysis in normal pancreas and pancreatic disease[J].Clin CancerRes,2000,6(2)∶566-571.

[19]DUPOUY S,VIARDOT-FOUCAULT V,ALIFANO M,et al.The neurotensin receptor-1 pathway contributes to human ductal breast cancer progression[J].PLoS One,2009,4(1)∶22-23.

[20]ALIFANO M,LOI M,CAMILLERI-BROET S,et al.Neurotensin expression and outcome of malignant pleural mesothelioma[J].Biochimie,2010,92(2)∶164-170.

[21]HASSAN S,DOBNER PR,CARRAWAY RE.Involvement of MAP-kinase,PI3-kinase and EGF-receptor in the stimulatory effect of Neurotensin on DNA synthesis in PC3 cells[J].Regul Pept,2004,120(1/2/3)∶155-166.

[22]AMORINO GP,DEEBLE PD,PARSONS SJ.Neurotensin stimulatesmitogenesisofprostatecancercellsthroughanovel c-Src/Stat5b pathway[J].Oncogene,2007,26(5)∶745-756.

[23]MÉLLER KM,TVETERAAS IH,AASRUM M,et al.Role of protein kinase C and epidermal growth factor receptor signalling in growth stimulation by neurotensin in colon carcinoma cells[J].BMC Cancer,2011,11∶421.

[24]MASSA F,TORMO A,B ÉRAUD-DUFOUR S,et al.Neurotensin-induced Erk1/2 phosphorylation and growth of human colonic cancer cells are independent from growth factors receptors activation[J].Biochem Biophys Res Commun,2011,414(1)∶118-122.

[25]OLSZEWSKI-HAMILTON U,HAMILTON G.Dependence of relative expression of NTR1 and EGFR on cell density and extracellular pH in human pancreatic cancer cell lines[J].Cancers,2011,3(1)∶182-197.

[26]BOSSARD C,SOUAZÉ F,JARRY A,et al.Over-expression of neurotensin high-affinity receptor 1(NTS1)in relation with its ligand neurotensin(NT)and nuclear beta-catenin in inflammatory bowel disease-related oncogenesis[J].Peptides,2007,28(10)∶2030-2035.

[27]CHESIRE DR,EWING CM,GAGE WR,et al.In vitro evidence for complex modes of nuclear beta-catenin signaling during prostate growth and tumorigenesis[J].Oncogene,2002,21(17)∶2679-2694.

[28]TURASHVILI G,BOUCHAL J,BURKADZE G,et al.Wnt signaling pathway in mammary gland development and carcinogenesis[J].Pathobiology,2006,73(5)∶213-223.

（童颖丹 编辑）

Significance of neuropeptide receptor 1 expression in gastric cancer and its correlation with β-catenin and EGFR

Dan-dan HUANG1,Min-hong YU2,Ying CAI2,Shu-dong YANG2,Rong-chao SUN2,Ying CHEN2,Zhi-yi ZHOU2
(1.Digestive Endoscopy Center,2.Department of Pathology,Wuxi People's Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Wuxi,Jiangsu 214023,P.R.China)

【objective】To investigate the possible associations of neuropeptide receptor 1(NTR1)expression with clinicopathological factors,prognosis,β-catenin and EGFR.【Methods】NTR1,β-catenin and EGFR expressions in tumor and adjacent normal tissues of 210 cases with gastric cancer treated by surgery were detected by the immunohistochemical method.The associations of NTR1 expression with clinicopathological data,prognosis,β-catenin and EGFR were analyzed.【Results】①NTR1 expression of the tumor tissues was significantly higher than that of the adjacent normal tissues.②NTR1 expression was positively correlated with the pathological grade,T stage,TNM stage and lymphatic metastasis.③A co-expression of NTR1 and βcatenin was found in 25.2％of the cases and NTR1 expression was positively correlated with β-catenin nuclear translocation and was not correlated with EGFR expression,however at the critical point(P=0.05);④Patients with higher expression of NTR1,higher pathological grade,diffusion Lauren's classification and higher TNM stage showed worse prognosis.Multivariate Cox analysis showed that high NTR1 expression and TNM clinical stage were the independent prognostic factors for patients with GC.【Conclusions】Patients with high NTR1 expression have a poor prognosis.NTR1 may play an important role in tumor progression of GC andhave its potential as a predictive biomarker and a therapeutic molecular target in GC.The interaction between NTR1 and β-catenin may participate in the development of gastric cancer,while the relationship between NTR1 and EGFR needs further investigation.

gastric cancer;neuropeptide receptor 1;clinical pathology;prognosis;β-catenin;epidermal growth factor receptor

R735.2

A

1005-8982（2015）35-0037-06

2015-04-08

周志毅，E-mail：zzywin2006@aliyun.com