一株还原制备纳米银的细菌菌株zxw01 的分离鉴定

张杰，熊文，张映，王娇，杨洪一*，王滨松

(1.东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨150040；2.黑龙江大学化学化工与材料学院，黑龙江 哈尔滨150080)

纳米银具有催化、抗菌、非线性光学及导热、导电等特性，在无机催化材料、抗菌剂、导电浆料等领域有着广阔的应用前景[1–4]。目前，纳米银制备多采用物理和化学方法，寻找简单环保的适合大规模制备的均一性好、稳定性好的纳米银制备方法，仍然是广大纳米材料研究者面临的富有挑战性的课题。相对于化学方法，生物方法合成具有条件温和、操作简单、环境友好等特点。藻类[5]、细菌[6–8]、真菌[9–11]等许多微生物与硝酸银作用都能制备纳米银粒子。细菌生长繁殖快，生长周期短，可大规模制备纳米银，是一种极具潜力的微生物材料。目前，关于制备纳米银优良菌株筛选的报道较少。笔者拟筛选出纳米银高产率化制备的优良菌株，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 土壤样品来源

于东北林业大学林场取土壤样品，共设6个样点，于距地面深20 cm处取样。将样品混合后组成代表样，装入无菌封口塑料袋内，于4℃冰箱保存，备用。

1.2 培养基

Luria–Bertani(LB)培养基的制备：将胰蛋白胨10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g 混合，加蒸馏水定容至1 000mL，pH 调至7.4。

改良Luria–Bertani(LB)培养基(不加NaCl，防止生成氯化银沉淀)的制备：将胰蛋白胨 10g 和酵母提取物 5g 混合，加蒸馏水定容至1 000mL，调pH 至7.4。

1.3 主要仪器与试剂

主要仪器：HZQ–F160A 型高低温恒温振荡培养箱(上海一恒科技有限公司)；GeneAmp9700 型PCR 扩增仪(美国应用生物系统中国公司)；himacCF16RX 型高速冷冻离心机(日本HITACHI 公司)；TECNAI G2 型透射电子显微镜(荷兰Philips– FEI 公司)；Bruker D8 型X–射线衍射仪(德国Bruker 公司)；热重分析仪(TGA/ DSC2)。

主要试剂：DNA 提取试剂盒和凝胶回收试剂盒(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)；E.coli JM109 感受态细胞(BioDev 公司)；pMD18–T Vector、PCR 反应用的试剂(大连TaKaRa 公司)；Tryptone、Yeast Extract 和NaCl(Oxied 公司)；细菌微量生化反应管(杭州天和微生物试剂有限公司)；氨苄青霉素(哈尔滨制药总厂)；其他常规试剂均为分析纯。

1.4 菌种的筛选

称取土壤样品5g，加入到装有5mL 蒸馏水的三角瓶中，制成土壤悬浮液。取1mL 悬浮液接种于改良的LB 液体培养基中，150 r/min 振荡，富集培养18 h 后，向富集培养液中加入硝酸银溶液，使硝酸银终浓度为0.1 mmol/L，避光驯化48 h，分别逐级提高硝酸银的浓度至0.2、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L。进行多次富集与驯化后，取1.0 mmol/L的菌液，在LB 固体培养基上进行浓度梯度稀释划线分离，得到能在含1 mmol/L 硝酸银的改良LB 培养基上存活的菌株，于4℃冰箱中保存，备用。

1.5 菌株的鉴定

1.5.1 常规鉴定

用透射电子显微镜观察所获得菌株的形态和大小，进行革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色[12]。采用细菌微量生化反应管对细菌的伏普(V–P)反应、硝酸盐培养基生长、糖发酵产酸、淀粉水解、明胶液化、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原和酪素分解[13–18]等生理生化试验进行鉴定。

1.5.2 16SrDNA 序列分析

菌株基因组采用细菌DNA 提取试剂盒提取，以细菌总DNA 为模板，利用细菌通用引物(27 F(5'–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3')和1492 R (5'–GGTTACCTGTTACGT–3')进行PCR 扩增。

PCR 反应体系：将10×PCR Buffer 5 μL、10 mmol/L 的dNTPs 1 μL、2.5 μmol/L 的上游和下游引物各4 μL、5 U/μLTaq 酶0.5 μL，DNA1 μL 模板混合，加去离子水至总体积50 μL。

PCR 反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2min，30个循环；72℃保温10min。4℃保存。

用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小和特异性。PCR 产物纯化后，用胶回收试剂盒回收目的片段，并与PMD18–T 连接，转化E.coli JM109，然后在含有氨苄霉素(AMP)的培养基中挑取白色单菌落(阳性转化子)进行PCR 扩增。将阳性克隆子送至上海生物工程公司进行测序，测序所获序列信息提交GenBank 核酸数据库，用BLAST 程序进行比对，搜索同源性较高的相关序列，采用MEGA5.2软件进行系统发育分析，并构建系统进化树。进化树分支稳定性用 Bootstrap 分析，重复1 000次。

1.6 纳米银的合成及表征方法

刮取固体平板菌种一环，接入LB 液体培养基中，于37℃恒温摇床上150 r/min 培养18 h，进行菌种活化。取5mL 活化好的菌株接入300mL 改良的LB 液体培养基中，于37℃恒温摇床150 r/min 振荡培养24 h。取198mL 细菌培养液，加入2mL 0.1 mol/L 的AgNO3溶液，使其Ag+终浓度为1 mmol/L，避光培养3 d。将培养液于14 000 r/min 离心10min，用蒸馏水洗沉淀3次，自然风干，得到纳米银颗粒。纳米银颗粒用X–射线衍射仪(XRD)进行表征，工作电压40 kV，扫描速度为10o/min；利用透射电子显微镜(TEM)在80 kV 电压下观察纳米银的形貌及纳米银的大小；采用热重分析仪(TGA)对离心得到的纳米银颗粒沉淀物进行分析。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选结果

通过逐级提高硝酸银的浓度，富集和驯化，筛选出了1 株能在含1 mmol/L 硝酸银改良液体LB 培养基中存活的菌株，将其命名为zxw01。加入AgNO3避光培养后，图1–c 中菌株的颜色由土黄色变为红棕色，而图1–a 和图1–b 中菌株的颜色无变化。这种明显的颜色变化与金属粒子的表面等离子体共振效应(SPR 效应)有关，据此，可初步判定菌株zxw01 有合成纳米银的能力。

图1 添加硝酸银前后菌株zxw01 的颜色变化 Fig.1 Color change of the zxw01 bacteria before and after AgNO3 added

2.2 菌株鉴定结果

2.2.1 菌落的形态及其生理、生化特征

由图2 可以看出，菌体呈杆状，大小为(1.23～1.78) μm ×(0.36～0.85) μm。

图2 菌株zxw01 的电镜照片 Fig.2 TEM image of zxw01

菌株zxw01 在LB 固体培养基上生长的菌落为圆形，表面光滑，边缘整齐，呈黄色，细菌革兰氏染色为阳性，芽孢染色可见卵圆形芽孢，孢囊膨大，中生或近中生，鞭毛染色可观察到菌株的鞭毛，光学显微镜暗视野中可观察到该细菌能运动。

从表1 可知，该菌株不能利用D–木糖、乳糖、L–阿拉伯糖、蜜二糖、山醇、甘糖、肌醇、甘露醇、鼠李糖、山梨醇和乳糖，可以利用柠檬酸、葡萄糖、果糖、尿素、马尿酸、麦芽糖和蔗糖，明胶液化、淀粉水解、过氧化氢酶、伏普(V–P )和硝酸盐还原试验结果均呈阳性，苯丙氨酸脱氨酶试验结果呈阴性。参照《伯杰细菌手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，可初步鉴定该菌为解淀粉酶芽孢杆菌。

表1 菌株zxw01 的生理生化试验结果 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain zxw01

2.2.2 zxw01 的分子生物学鉴定结果

以菌株基因组DNA 为模板，以细菌16 SrDNA的通用引物进行RCR 扩增，对菌株的16 SrDNA 进行测序，得到1 514 bp 序列。将测序结果提交到GenBank，登录号为KF 700242。用BLAST 程序将获得的16 SrDNA 序列与GenBank 中的所有序列进行核苷酸同源性对比，采用MEGA5.2 软件构建系统发育树，用自展法(Bootstrap)检验系统发育树的可靠性，自展1 000次得到菌株zxw01 的系统进化树(图3)。由图3 可见，菌株zxw01 与解淀粉酶芽孢杆菌属形成一个族群，且同源性达99%以上。结合形态学、生理生化特征以及16 SrDNA 分析，最终将zxw01 鉴定为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens )。

图3 基于16SrDNA 序列同源性构建的系统发育树 Fig.3 Phylogenetic tree of the bacteria strain based on 16 SrDNA sequenceshomology

2.3 纳米银的XRD 分析结果

由图4 可以看出，在2θ 斜角为38.23°、44.56°、64.87°和77.48°处出现了明显的特征性衍射峰，与JCPDS 卡 04–0783 上的数据(2θ 为 38.096°、44.257°、64.406°和77.452°)吻合，分别对应于立方晶系银的(111)、(200)、(220)和(311)，说明该细菌在添加硝酸银后合成了面心立方结构的纳米银颗粒，并且纳米银是无杂质的。

图4 利用zxw01 培养液合成的纳米银XRD 衍射图谱 Fig.4 XRD pattern of AgNPs synthesized by the bacteria strain of zxw01

2.4 纳米银的TEM 分析结果

由图5 可清楚地观察到银纳米粒子的形态和粒径大小，大部分为球形或近球形，粒径大小为2～18 nm，平均粒径为12.6 nm，粒径分布窄且较均匀，具有较好的分散性，几乎没有团聚现象。

图5 zxw01 培养液合成纳米银的TEM 图谱 Fig.5 TEM image of AgNPs synthesized by the bacteria strain of zxw01

2.5 纳米银颗粒的热重分析结果

Ag+终浓度为1 mmol/L 的培养液200mL 制备纳米银，最终离心后可获得0.03g 的纳米银颗粒沉淀物。对沉淀物进行热重分析的结果(图6)表明，随着加热温度的升高，纳米银颗粒的质量逐渐减少，当温度上升到580℃时达到热稳定状态，不再有质量损失。其原因在于离心后得到的纳米银颗粒沉淀中含有的水和有机物，这些水和有机物在加热过程中不断释放，最后达到稳定。热稳定状态时得到的纳米银质量为纳米银颗粒沉淀物质量的58%，由此可知，纳米银的实际产量为0.017 4g(0.03×58%)，又知纳米银的理论产量为0.021 6g(0.2 (L)×1×10－3(mol/L)×108(g/mol))，因此，纳米银产率为80.6%(实际产量/理论产量)。

图6 纳米银的热重分析 Fig.6 Thermogravimetric analysis of silver nanoparticles

3 结论与讨论

逐渐加大硝酸银浓度进行富集与驯化，筛选得到1 株能还原制备纳米银的菌株zxw01。该菌株能在含1 mmol/L 硝酸银的改良LB 液体培养基中存活，并且能使得添加硝酸银的菌株培养液由土黄色变为棕红色，合成的纳米银是分散的，呈球形或近球形，粒径为2～18 nm，纳米银产率为80.6%。经个体形态特征鉴定、生理生化特征鉴定和16 SrDNA 序列分析，将该菌鉴定为解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyqueciens)。

目前，在同类研究中，用细菌制备纳米银比用真菌更具优势。细菌繁殖快，生长周期短，且关于细菌的发酵和遗传改造经验比关于真菌的更为丰富，这有利于基因工程操作，可以利用基因工程技术，使特定的具有还原作用的酶以及起稳定作用的蛋白大量表达，从而实现纳米粒子的大规模制备，所以，细菌在纳米银合成领域具有发展潜力，有待进一步研究。

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