多指标综合评分法优选清热解毒口服液的提取工艺

高天曙，王会丽，赵义红

(1.河南省中医院 药学部，河南 郑州 450004；2.河南省中医药研究院 肝胆脾胃科，河南 郑州 450004；3.河南省中医药研究院附属医院 赵国岑名医工作室，河南 郑州 450000)



多指标综合评分法优选清热解毒口服液的提取工艺

高天曙1，王会丽2，赵义红3

(1.河南省中医院 药学部，河南 郑州 450004；2.河南省中医药研究院 肝胆脾胃科，河南 郑州 450004；3.河南省中医药研究院附属医院 赵国岑名医工作室，河南 郑州 450000)

目的 优选清热解毒口服液最佳提取工艺。方法 以加水量、提取时间、提取次数和含醇百分率为考察因素，每因素设计3个水平，以黄芩苷、绿原酸和栀子苷转移率及浸膏得率为指标，进行加权综合评价， 用L9(34) 正交表安排试验。结果 清热解毒口服液最佳的提取工艺为加8倍量水提取3次，每次1h，含醇百分率为70%。结论 验证试验表明通过正交试验得到的清热解毒口服液提取工艺设计合理，结果可靠，提取效果较好，具有较高的应用价值。

多指标综合评分；清热解毒口服液；正交试验；提取工艺

清热解毒口服液由金银花、玄参、地黄、连翘、栀子等12味中药组成，收载于卫生部药品标准中药成方制剂第七册[1]，方中重用石膏清热泻火，生津止渴为君药；栀子、黄芩、龙胆清热泻火，双花、连翘、甜地丁、板蓝根清热解毒，玄参、生地黄清热凉血，诸药均助君药清热泻火解毒为臣药；知母、麦冬清热生津为佐药，有清热解毒、生津止渴等功效。本文采用L9(34) 正交试验表，以加水量、提取时间、提取次数和含醇百分率为考察因素[2-3]，以黄芩苷、绿原酸和栀子苷3者的含量为综合评价指标对其提取工艺进行了优选研究，以期为临床合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品 处方药材(江苏省医药公司)，经鉴定均符合《中国药典》2010年版一部的相关标准；黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110715-201016)；绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110753-201314)；栀子苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110749-201316)。

1.2 仪器 Waters高效液相色谱仪，包括1525溶液输送泵、2487紫外可变波长检测器; Breeze工作站(购自Waters公司)；JK-5200型超声波清洗器(购自合肥金尼克机械制造有限公司)；XS205DU电子天平(购自梅特勒有限公司)。甲醇、乙腈为色谱纯(Fisher公司)，其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 浸膏得率的测定[2]：将按正交试验得到的各样品提取液分别转移至1000 mL量瓶中，加水定容，各精密量取20 mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，残渣于105 ℃干燥至恒重，放冷至室温后称重，计算浸膏得率。

1.3.2 黄芩的含量测定：① 色谱条件：色谱柱：Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：甲醇-水-磷酸(50︰50 ︰0.3)；检测波长：276 nm；柱温：室温。

② 对照品溶液的制备： 精密称取黄芩苷对照品(五氧化二磷减压干燥至恒重)加70%乙醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

③ 供试品溶液的制备： 精密量取按正交试验得到的各样品提取液2 mL，置100 mL量瓶中，加70%乙醇适量，振摇，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

④ 阴性样品溶液的制备：按照清热解毒口服液的处方制备不含黄芩的样品，按照③项下的方法操作，制成阴性样品溶液。

⑤ 线性关系的考察：精密称取黄芩苷对照品适量，加70%乙醇制成每1 mL含黄芩苷50 μg的溶液，精密吸取上述对照品溶液2、8、10、12、25 mL 置50 mL 棕色量瓶中，分别加70%乙醇定容至刻度，摇匀，制得不同浓度的对照品溶液。取上述对照品溶液，按照1.3.2 项下①色谱条件分别进样10 μL 分析，记录峰面积。

⑥ 精密度实验：精密量取黄芩苷对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，重复进样6次，记录峰面积。

⑦ 稳定性实验：精密吸取同一黄芩苷对照品溶液10 μL，室温放置，分别在0、2、4、 6、 8、24 h进样，记录色谱峰面积，考察其溶液稳定性。

⑧ 加样回收率实验：精密量取已知含量的样品提取液2 mL，共6份，分别置100 mL量瓶中，各精密加入适量的黄芩苷对照品溶液，加70%乙醇适量，振摇，滤过，取续滤液即得，精密量取上述溶液10 μL，分别进样，测定并计算回收率(以黄芩苷计)。

1.3.3 金银花的含量测定：

① 色谱条件：色谱柱：Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液(13:87)；检测波长：325 nm；柱温：室温。

② 对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL中含绿原酸20 μg的溶液，即得(10 ℃以下保存)。

③ 供试品溶液的制备：精密量取按正交试验得到的各样品提取液1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇适量，振摇，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

④ 阴性样品溶液：按照清热解毒口服液的处方制备不含金银花的样品，照③项下的方法操作，制成阴性样品溶液。

⑤ 线性关系的考察：精密称取绿原酸对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL含绿原酸100 μg的溶液，精密吸取上述对照品溶液2、8、10、12、25 mL 置50 mL 棕色量瓶中，分别加50%甲醇定容至刻度，摇匀，制得不同浓度的对照品溶液。取上述对照品溶液，按照1.3.3 项下①色谱条件分别进样10 μL 分析, 记录峰面积。

⑥ 精密度实验：精密量取绿原酸对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，重复进样6次，记录峰面积。

⑦ 稳定性实验：精密吸取同一绿原酸对照品溶液10 μL，室温放置，分别在0、 2、 4、 6、 8、 24 h进样，记录色谱峰面积，考察其溶液稳定性。

⑧ 加样回收率实验：精密量取已知含量的样品提取液1 mL，共6份，分别置25 mL量瓶中，各精密加入适量的绿原酸对照品溶液，加50%甲醇适量，振摇，滤过，取续滤液即得，精密量取上述溶液10 μL，分别进样，测定并计算回收率。

1.3.4 栀子的含量测定：

① 色谱条件：色谱柱：Hypersil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相 ：乙腈-水(12︰88)；检测波长：238 nm；柱温：室温。

② 对照品溶液：精密称取栀子苷对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

③ 供试品溶液：精密量取按正交试验得到的各样品提取液1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇适量，振摇，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

④ 阴性样品溶液：按照清热解毒口服液的处方制备不含栀子的样品，按照1.3.4项下②的方法操作，制成阴性样品溶液。

⑤ 线性关系的考察：精密称取栀子苷对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL含栀子苷250 μg的溶液，精密吸取上述对照品溶液2、8、10、15、25 mL 置50 mL 棕色量瓶中，分别加50%甲醇定容至刻度，摇匀，制得不同浓度的对照品溶液。取上述对照品溶液，按1.3.4 项下①色谱条件分别进样10 μL分析, 记录峰面积。

⑥ 精密度实验：精密量取栀子苷对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，重复进样6次。

⑦ 稳定性实验：精密吸取同一栀子苷对照品溶液10 μL，室温放置，分别在0、2、4、6、 8、24 h进样，记录色谱峰面积，考察其溶液稳定性。

⑧ 加样回收率实验：精密量取已知含量的样品提取液1 mL，共6份，分别置25 mL量瓶中，各精密加入适量的栀子苷对照品溶液，加50%甲醇适量，振摇，滤过，取续滤液即得，精密量取上述溶液10 μL，分别进样，测定并计算回收率。

1. 3 样品含量测定 分别精密量取正交试验项下1～9号样品溶液各10 μL，分别按照“1.3.2”“1.3.3”及“1.3.4”项下①色谱条件进样，测定各成分峰面积。

1.4 正交试验优选提取工艺 根据生产工艺并结合处方中各药材的理化性质来选择考察因素，预实验表明，浸泡时间(浸泡1h即可)对提取效果的影响很小，故本实验选择对提取效果影响较大的加水量、提取时间、提取次数和含醇百分率4个因素进行优化，每因素设计3个水平，以黄芩苷、绿原酸和栀子苷转移率及浸膏得率为指标，进行加权综合评价，因素水平表选择L9(34) 正交表，见表1。

表1 因素水平表Tab.1 Factor and level of orthogonal design

1.5 正交试验方法[4]按处方比例称取9个处方量的金银花、玄参、地黄、连翘、栀子等十二味药材，先温浸1 h，分别按正交试验设计进行煎煮(待沸腾后，稍冷加金银花和黄芩)，滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度为1.17，最后加入一定量的乙醇，按正交试验设计进行提取，各提取液均冷藏48 h，滤过，回收乙醇，加入0.5%的活性碳，加热30 min，滤过，滤液加水至1000 mL，定容，备用。

2 结果

2.1 黄芩的含量测定

2.1.1 黄芩苷的线性方程：以平均峰面积(A)为纵坐标Y，进样的质量浓度(mg/L)为横坐标X，进行线性回归，得黄芩苷的回归方程Y=5.01×105+4.35×103(r=0.9993)，由结果可知，黄芩苷的线性范围为2～25 mg/L 。

2.1.2 精密度实验：黄芩苷峰面积的RSD为1.56%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性实验：黄芩苷峰面积的RSD为1.7 8%，表明黄芩苷对照品溶液在24 h内基本稳定。

2.1.4 加样回收率实验：结果测得黄芩苷的平均回收率为100.28%，RSD=1.79%(n=6)。

2.2 金银花的含量测定

2.2.1 绿原酸的线性方程：以平均峰面积(A)为纵坐标Y，进样的质量浓度(mg/L)为横坐标X，进行线性回归，得绿原酸的回归方程Y=6.37×105-7.03×104(r=0.9996)，由结果可知，绿原酸的线性范围为4～50 mg/L 。

2.2.2 精密度实验：绿原酸峰面积的RSD为1.61%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性实验：绿原酸峰面积的RSD为2.19%，表明绿原酸对照品溶液在24 h内基本稳定。

2.2.4 加样回收率实验：结果测得绿原酸的平均回收率为97.82%，RSD=2.21%(n=6)。

2.3 栀子的含量测定

2.3.1 绿原酸的线性方程：以平均峰面积(A)为纵坐标Y，进样的质量浓度(mg/L)为横坐标X，进行线性回归，得栀子苷的回归方程Y=5.73×104-3.79×103(r=0.9997)，由结果可知，栀子苷的线性范围为10～125 mg/L。

2.3.2 精密度实验：栀子苷峰面积的RSD为1.72%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性实验：栀子苷峰面积的RSD为1.57%，表明栀子苷对照品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.4 加样回收率实验：结果测得栀子苷的平均回收率为99.73%，RSD=1.62(n=6)。

2.4 正交试验结果 正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 正交试验结果Tab.2 Results of the orthogonal )

注：综合评分=0.4×W黄芩苷量/WMax黄芩苷量+0.2×W绿原酸量/WMax绿原酸量+0.3×W栀子苷量/WMax栀子苷量-0.1×W浸膏得率/WMax浸膏得率

本实验对正交试验的结果进行了加权综合评分分析，加权综合评分[5-8], 是指运用数学方法对复杂体系中的多个指标信息进行分析处理，根据复杂体系中各指标信息的贡献大小给予它们不同的权重系数。根据清热解毒口服液的处方及其质量标准中对各主要成分的含量规定来分配权重系数，即黄芩苷0.4，绿原酸0.2，栀子苷0.3，浸膏0.1。因为本制剂为口服液，浸膏越少，澄明度及稳定性越好，所以浸膏得率为负向指标，其余3项均为正项指标。

表3 方差分析表Tab.3 Table of variance analysis

由以上表格直观分析可知，对于黄芩苷，各因素影响程度的大小为：C>A>D>B，对于绿原酸，各因素影响程度的大小为：C>D>A>B，对于栀子苷，各因素影响程度的大小为：C>A>B>D，对于负向指标浸膏得率，各因素影响程度的大小为：C>D>B>A，对各影响因素加权后综合评分分析，各因素顺序为：C>D>A>B，即提取次数对提取效果的影响是最大的，其次是含醇量和加水量，最后是提取时间。可见，在提取次数满足一定要求后，提取时间对提取效果的影响不是很明显；另外，加水量和含醇量是药材中有效成分能提取完全的前提，本提取方法采用的是“水提醇沉”工艺，包含水溶性有效成分的充分溶出和杂质的过滤，含水量和含醇量对于本工艺来说是两个非常重要的指标。

下面分析各影响因素指标在各水平的排列顺序：

黄芩苷：A3>A1>A2，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D3>D2>D1;

绿原酸: A1>A3>A2，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D3>D2>D1;

栀子苷：A3>A1>A2，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D2>D3>D1;

浸膏：A3>A2>A1，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D1>D2>D3;

加权综合评分：A3>A1>A2，B3>B2>B1，C3>C2>C1，D3>D2>D1。

2.5 正交试验优选结果 经直观分析和方差分析并结合实际生产工艺的情况，得出选清热解毒口服液最佳提取工艺为A2B2C3D3，即加8倍量的水提取3次，每次1h，然后加入乙醇精提，使含醇量达到70%。

2.6 验证试验 按处方组成比例称取3份药材，采用优选的提取工艺进行验证试验，测定结果见表4。

表4 优选工艺验证结果(n=3，%)Tab.4 Validation results of the optimized test (n=3,%)

3 讨论

由于绿原酸是热不稳定性化合物[9]，不宜长时间加热，而通过正交试验设计发现，提取次数对提取效果的影响是最大的，在提取次数满足一定要求时，提取时间对提取效果的影响不是很明显，因此在选择提取时间上，本研究选择了B2，即1 h,这个结果与以往绿原酸的提取时间吻合[10-11]。

本处方提取采用的是“水提醇沉”工艺[12-14]，“水提醇沉”工艺法是常用于中药水提取液的纯化精制方法，药材先经水煎提取，其中生物碱、有机酸盐、氨基酸类等水溶性有效成分被提取出来，同时也浸提出很多水溶性杂质，然后在提取液中加入一定量的乙醇，利用有效成分能溶于乙醇而杂质不溶于乙醇的特性，将有效成分转溶于乙醇中而使杂质沉淀出来。“水提醇沉”的第一个前提是加水量，加水量对药材中有效成分的充分溶出有很大的影响，而含醇量则是将有效成分进行精提的关键，含醇量过多，药材中有效成分损失严重；含醇量太低则会导致杂质过多。

综上所述，通过正交试验优化设计，选择了加8倍量的水提取3次，每次1h，然后加入乙醇精提，使含醇量达到70%。

[1] 卫生部药品标准中药成方制剂第七册[s].WS3-B-1436-93[2]张玲昂, 徐丽娜, 顾腾飞.正交试验法优选咽炎清口服液提取工艺[J].中国药师，2013,16(2)：249-251.

[2] 刘弘，王俊杰，张玲昂，等. 心得宁口服液提取工艺优选[J]. 中国药师，2014,17(4)：598-600.

[3] 国家中成药标准汇编口腔肿瘤儿科分册[s].WS-11465(ZD-1465)-2002.

[4] 王洁贞，李颖琰，陈冠民．医学统计学[M]．郑州：郑州大学出版社，2002.137-144.

[5] 王洁，宋忠兴，郭东艳，等．多指标综合加权评分法优选桑蒂复肝胶囊的提取工艺[J]. 现代中医药，2010，30(1)：56-58.

[6] 张琳，吴皓，朱涛.多指标综合加权评分法优选法半夏炮制工艺[J].中药材，2008,31(1)：20-23.

[7] 郭东艳，张丽娟，师延琼，等.基于谱效相关的多指标综合加权评分法优选生地黄的提取工艺[J].中成药，2011，33(12)：2183-2185.

[8] 刘弘, 王俊杰, 张玲昂，等.加权综合评分法优化心得宁口服液提取工艺的研究[J].中医学报，2014,29(188)：76-78.

[9] 余杰,匡辽红.正交试验研究金银花的水提工艺[J].现代药物与临床，2010，25(4)：293-296.

[10] 李宁，李楚.金银花中绿原酸提取工艺的正交优化法研究[J].山西农业科学，2010，38(3)：14-15，22.

[11] 王爱萍，郑茂东，徐今宁，等.金银花中绿原酸的提取工艺及制剂研究进展[J].中国药业，2013，22(14)：9-11.

[12] 何雁，辛洪亮，黄恺. 水提醇沉法中醇沉浓度对板蓝根泡腾片制备过程的影响[J].中国中药杂志，2010，35(3)：288-292.

[13] 倪红飞，刘彩琴，徐冬梅.水提醇沉法提取红参多糖最佳工艺研究[J].浙江树人大学学报, 2012,12(1):21-24.

[14] 孙莹， 纪跃芝，马爱民，等.水提醇沉法提取大黄多糖工艺优化研究[J].中国实用医药，2010，5(18)：6-8.

(编校：王冬梅)

Optimize the extraction process of Qingrejiedu oral liquid by multi-index comprehensive evaluation

GAO Tian-shu1, WANG Hui-li2, ZHAO Yi-hong3

(1.Department of Pharmacy, Henan Traditional Chinese Medicine Hospital, zhengzhou 450004, China; 2.Department of Liver and Spleen, Henan Chinese Medicine Research Institute,zhengzhou 45000, China; 3. Doctor Zhao Guocen Studio, Affiliated Hospital of Henan Chinese Medicine Research Institute, zhengzhou 450000, China)

ObjectiveTo optimize the extraction techique for Qingrejiedu oral liquid.MethodsThe amount of water, extraction time , extraction times and alcohol content were used as inspection factor, 3 levels per factor, with baicalin, chlorogenic acid , geniposide transfer rate and extraction rate as indexes,carries on Weighted comprehensive evaluation,the optimal extractin were screened by L9(34) orthogonal test.ResultsThe optimal extraction condition of Qingrejiedu oral liquid were as follow:extraction for 3 times and 1h each time with 8-fold amount of water and 70% alcohol.ConclusionThrough the orthogonal test, the extraction process of Qingrejiedu oral liquid is designed reasonably, the result is reliable, and the extraction effect is good, and has higher application value.

multi-index comprehensive evaluation; Qingrejiedu oral liquid; orthogonal test; extraction process

高天曙，男，本科，主管药师，研究方向: 中药药理与中药临床研究，E-mail： 3157797926@qq.com。

R969.3

B

1005-1678(2015)07-0141-04