原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球的制备及理化特性研究

王大卫，温宝芳，商洪才，冯占芹，张维芬,Δ

(1.朐山医院 中医内科，山东 临朐 262600；2.潍坊医学院 临床学院，山东 潍坊 261053；3.北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室/中医内科学北京市重点实验室，北京 100000；4.潍坊医学院 药学院，山东 潍坊 261053)



原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球的制备及理化特性研究

王大卫1†，温宝芳2†，商洪才3，冯占芹4，张维芬3,4Δ

(1.朐山医院 中医内科，山东 临朐 262600；2.潍坊医学院 临床学院，山东 潍坊 261053；3.北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室/中医内科学北京市重点实验室，北京 100000；4.潍坊医学院 药学院，山东 潍坊 261053)

目的 制备原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球并对其理化特性进行考察。方法 采用喷雾干燥法制备原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球，扫描电镜观察不同药物载体比例微球的粒径、外观，并对其体外释放、含水率、溶胀率、固密度等理化特性进行考察。结果 喷雾干燥法成功构建原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球A、B、C 3种微球，电镜结果显示原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球平均外观圆整，表面有褶皱，粒径在2～15 μm分布均匀；体外释放结果表明，原花青素A、B、C 3种微球累计释放分别为25.07%、38.83%和60.00%，无突释现象；原花青素24 h时累计释放分别为28.42%、41.82%和67.52%，48 h累计释放分别为28.89%、43.17%和72.86%，微球具有缓释作用。含水率、溶胀率、固密度结果分为15.35%～23.51%、46.50%～105.80 %、0.375～0.496。结论 喷雾干燥法成功构建原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球，微球表面有褶皱，粒径固密度、溶胀等特性良好，具有缓释作用，有望成为肺吸入给药的良好载体。

原花青素；白芨多糖；壳聚糖；喷雾干燥；微球；理化特性

近年来研究发现，大气颗粒物严重影响人体健康，PM2.5每年造成80万人死亡，已经成为致死的重要因素[1]。大气颗粒物是悬浮于空气中颗粒的总称，按照其空气动力学粒径分为总悬浮颗粒物(TSP， 空气动力学直径小于 100 μm，下同)、可吸入颗粒物(PM10)、细颗粒物(PM2.5)和超细颗粒物(PM0.1)[2]。PM10通常沉积在上呼吸道、气管和主支气管；PM2.5主要沉积到细支气管、肺泡[3]，其中更细的成分PM0.1还可以穿过肺泡进入血液。短期暴露于PM2.5与呼吸系统疾病的入院率有关，PM2.5质量浓度每升高10 μg/m3，呼吸系统疾病的病死率就会升高1.51%[4]。研究人员对北京市PM2.5暴露的急性健康损害风险和经济损失进行了评估，结果显示急性支气管炎和哮喘是 PM2.5引发的主要疾病，占90%以上[5]。大气粗颗粒物可诱导人肺 A549 上皮细胞产生大量超氧阴离子和过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)等，引起细胞氧化应激[6]。PM2.5进入机体后，可促进一氧化氮( nitric oxide，NO)、一氧化氮合成酶( nitric oxide synthase，NOS) 、丙二醛(malonaldehyde，MDA)等氧化产物增加，同时抑制谷胱甘肽过氧化物(glutathione peroxidase，GSH-Px) 、超氧化物歧化酶( superoxide dismutase，SOD) 、过氧化氢酶(catalase，CAT)等抗氧化产物的产生，最终导致机体总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)下降[7]。PM2.5容易吸附各种有毒的有机物和重金属，引起氧化应激和炎症反应，导致机体损伤，被认为是影响健康的主要作用机制[8]。由此可见，空气污染对健康的影响已成为我国重要的公共卫生问题，针对PM2.5造成的健康风险进行有效的干预，已成为我国医药研究领域亟需解决的重大科学问题，而目前尚无有效的预防及治疗办法，如何利用中医药特有的优势对相关疾病进行科学、有效应对也成为医药工作者重要的责任、契机和挑战[6]。

原花青素(proanthocyanidins，PC)是葡萄籽中提取的多酚类物质，是由儿茶素、表儿茶素及其没食子酸酯组成的多聚体[9]，具有抗肿瘤、抗氧化、清除自由基、保护心血管等药理作用[10-11]。马玉红等[13]研究H2O2诱导PC12细胞的内质网应激损伤作用及原花青素对其预防作用发现，原花青素可以显著减少细胞内活性氧(ROS)生成，结果表明原花青素可减轻H2O2引起PC12细胞的内质网应激损伤。赵艳萌等[12]研究发现葡萄籽原花青素对顺铂所致大鼠肾脏氧化损伤和线粒体损伤具有防护作用。原花青素是一种很好的氧自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂[13]，但原花青素体外稳定性差，随聚合度增加，口服吸收降低[14-15]，临床应用受到限制。因此，利用原花青素具有抗氧化损伤的优势，通过新剂型和给药途径研究，提高原花青素的生物利用度，促进药物吸收。

肺吸入微球给药系统是近年来发展起来的新剂型，微球沉积于肺部可以延缓药物的释放，且可保护药物不受酶的水解，可以通过工艺的优化，得到大小、形状和孔隙率符合要求的微球，这些特性决定了微球是较好的肺部给药制剂，生物可降解微球作为肺部控释给药载体受到广泛关注。

采用生物降解材料制备的微粒载药系统被广泛用于干粉吸入给药[16-17]，作为天然可降解的高分子载体材料，壳聚糖微球具有的独特的物理化学和生物学性质，使其尤其适用于肺部给药系统[18-20]。白芨多糖是从白芨药材中经一定工艺提取所得的多糖 ，具有抗炎 、 促凝血 、 抗病毒 、 抗肿瘤 ，抗氧化等生物学活性[21]， 作为天然高分子材料 ， 有功能缓释性、局部滞留性、自身降解性、无刺激性、无不良反应等特性，用白芨胶制备的混悬型洗剂、搽剂，稳定性好[22]。

本研究以白芨多糖/壳聚糖作为药物载体，原花青素为模型药物，采用喷雾干燥法制备原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球，并对微球形态、粒径、含水率、溶胀率、固密度、体外释放等理化特性进行评价，为开发防治PM2.5引起肺氧化损伤的吸入给药系统提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 壳聚糖(CTS，脱乙酰度≥85%，山东莱州市海力生物制品有限公司)；冰乙酸(青岛海滨试剂，AR)；白芨多糖(北京华清美恒天然产物技术开发有限公司)；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(上海化学试剂公司，AR)。

1.2 仪器 EL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；Büchi®290小型喷雾干燥仪(瑞士步琦有限公司，喷嘴直径0.7 mm)；JCM-6000 NeoScope 台式扫描电镜(Scanning Electron Microscope，怡星公司)；UV-8000/8000A/8000S双光束紫外分光光度计(Ultraviolet Spectrophotometric， 上海元析仪器有限公司)；GWJ-4型智能粒径检测仪(天津天大天发科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球的制备：精密称取室温下真空干燥至恒重的白芨多糖及原花青素各适量，溶于1000 mL 0.5%的壳聚糖乙酸溶液中，0.45 μm微孔滤膜过滤，续滤液经蠕动泵导入Büchi290小型喷雾干燥器的双流向螺旋式喷嘴，喷雾干燥条件为进口温度：110 ℃、出口温度：55 ℃～75 ℃，进料速度：3 mL/min、空气流量：400 L/h，喷雾干燥“一步”制得微球粉末A、B、C、D，收集微球粉末于干燥器中，备用条件见表1。

表1 喷雾干燥微球的处方组成(%，W/V)Tab.1 Composition of formulations used for aqueous solution to be spry dried(%，W/V)

1.3.2 微球粒径：取适量干燥后的载药微球加至超纯水中，磁力搅拌器使其分散均匀后，放入激光粒度分析仪中测定微球的直径及粒径分布。

1.3.3 微球形态：取少许粉末样品撒于样品盖上，喷金，然后在高压条件下成像，用扫描电镜观察。

1.4 含水率 取数个规格相同且干燥恒重的称量瓶，分别称其重量记为Wn，分别加入适量的微球后称其重量，记为W(其中药物重为W-Wn)，移至105 ℃烘箱中干燥4 h，取出，置干燥器中冷却30 min，迅速称定重量(W′)，再置105 ℃烘箱中干燥0.5 h，取出，置干燥器中冷却30 min，迅速称定重量(W′)，2次恒重之差不超过0.3 mg，计算微球的含水率。则含水率的计算公式为(1)：

(1)

1.5 溶胀率 精密称取干燥的原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球适量(Wd)分散于5 mL试管中，加入4 mL 磷酸盐缓冲溶液(0.2 M，pH 6.8)溶解，漩涡振荡5 min，置于室温12 h以上直至达到溶胀平衡，离心，弃去上清液，用滤纸将微球表面的水分吸干，精密称重溶胀后的微球 (Wn)，按下式计算溶胀率(SR%)(2)：

(2)

1.6 固密度 参考USP24附录(616)的方法测定粉末固密度，将各处方的粉末填充于小塑料瓶(5 mL)中，从一定高度(约14 mm)按规定次数(20次)落下，利用落下的撞击力使粉末装紧，并不断加入粉末，直至填满且溢出瓶口，刮去多余粉末，准确测定粉末重量及塑料瓶内容积，将粉重和容积相比即得粉末的固密度。

1.7 体外释放 精密称取不同比列微球置于扎紧一端的透析袋内(MWCO：3500)，加释放介质0.2 M pH 6.8磷酸盐缓冲液2 mL封口，置于装有50 mL释放介质的具塞锥形瓶中于37 ℃条件下，恒温振荡器(100 r/min)定时取样2 mL释放介质，并随时补充同温等量新鲜介质，以空白微球为对照，在286 nm波长处测定吸光度(A)，根据标准曲线回归方程，计算原花青素在溶液中的累计释放量(cumulative release， CR)(3)：

(3)

式中：Mt是微球在PBS溶液中t时间时茶碱的释放量，M0为微球中的药物含量。

2 结果

2.1 微球的电镜扫描结果 微球表面呈光滑球形、半褶皱或全褶皱的3种不同形态微粒，随着白芨多糖含量的升高，喷雾干燥微粒表面褶皱程度逐渐不明显,白芨多糖/壳聚糖空白微球D表面呈光滑球形。微球A均有褶皱，大小均匀，无粘连；微球B具有褶皱，粒径较不均匀；微球C有的具有半褶皱，部分表面光滑，有粘连；白芨多糖/壳聚糖空白微球D大部分表面光滑，分布均匀，无明显粘连。见图1。

图1 微球的电子显微镜扫描图A.原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球(1︰1 ︰1)；B.原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球(1︰2 ︰1)；C.原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球(1︰4 ︰1)；D. 白芨多糖/壳聚糖空白微球(1︰1)Fig.1 Scanning electron micrograph images of chitosan and amino-chitosanA. PC/ BSP/CTS microspheres (1:1:1); B.PC/ BSP/CTS microspheres(1:2:1);C.PC/BSP/CTS microspheres (1:4:1); D.Blank BSP/CTS microspheres(1︰1)

2.2 不同药物载体比例原花青素微球的粒径 用粒度分析仪测得所制备的原花青素/白芨多糖/壳聚糖4种微球粒径的分布范围分别是10～20、2～15、10～25、2～15 μm，粒径分布在2～15 μm范围内的微球占总数的87.9%，各组微球粒径分布较均匀。见图2。

图2 不同药物载体比例原花青素微球的粒径A.原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球(1︰1 ︰1)；B.原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球(1︰2 ︰1)；C.原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球(1︰4 ︰1)；D.白芨多糖/壳聚糖空白微球(1︰1)Fig.2 The PC microspheres particle size of the proportion of different drug carriers(n=3)A.PC/ BSP/CTS microspheres (1:1:1); B.PC/ BSP/CTS microspheres(1:2:1);C.PC/BSP/CTS microspheres (1:4:1); D.Blank BSP/CTS microspheres(1:1)

2.3 不同药物载体比例原花青素微球的含水率、溶胀率和固密度 在相同的相对湿度和时间条件下，微球A，B，C，D的含水率分别为19.20%，26.51%，15.35%，16.80%，见图3(A)。由此图可以知，在相同的相对湿度和时间时，微球C含水率低于其他3种微球，这会使颗粒间易于粘连，影响微球的性能。

图3 不同药物载体比例原花青素微球的(A)含水量、(B)溶胀率、(C)固密度(n=3)Fig.3 The moisture content , swelling rate, and tapped density of microspheres(n=3)(A)Moisture content,(B): Swelling rate,(C)Tapped density

在pH 6.8的溶液中微球12 h以上直至达到溶胀平衡，原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球(pH 6.8)的溶胀结果表明，微球A，B，C，D的溶胀率分别为105.80%，46.50%，73.62%，95.71%，见图3B。

原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球A、B、C、D的固密度值分别是0.38、0.49、0.42、0.40 g/cm3，见图3(C)。

2.4 体外释放 药物/载体比例是影响微球释放的重要因素，由图4可知，微球A、B、C在最初2 h内原花青素累计释放分别为25.07%、38.83%和60.00%，没有突释现象。原花青素的释放随白芨多糖含量的增加，药物释放速度加快。微球C在2 h内达到60.00%，而微球A仅释放25.07%。微球C在24 h时原花青素累计释放67.52%，微球A、B在同一时间段内仅为28.42%、41.82%，微球C释放比微球A、B快，这一结果表明，载体白芨多糖比例继续增加，缓释作用增强。微球A、B、C在48 h原花青素累计释放量分别为28.89%、43.17%和72.86%，随着时间的延长，微球中原花青素释放速率降低。微球中原花青素释放速率Microspheres A

图4 不同药物载体比例原花青素微球的体外释放(PBS, pH 6.8，n=3)Fig.4 Release profile of PC microspheres of the proportion of different drug carriers at PBS (pH 6.8, n=3)

3 讨论

粒子形态影响沉积性能，药物粒子间若接触紧密，会导致难以分离，因此要减小粒子之间的相互接触面积，降低粒子的表面自由能[23]。Adi等[24]用不同的喷雾干燥参数制备了不同表面皱褶度的牛血清白蛋白药物粒子，结果显示，当皱褶度增大时，粒子之间的黏附力减小，药物的可吸入细粉组分值增大。He等[25]已有相关文献报道，微球表面的皱折可能是喷雾干燥过程中的条件、处方组成等多种因素造成的。Chew等[26]报道表面带有皱折的实体圆形微球要比光滑微球具有更高的呼吸分数。褶皱性粒子提高药物微粒可吸入性的关键，在于微粒的褶皱性降低了微粒与载体的相互作用力，从而减小微粒间的聚集[27]，以提高微粒的分散性和可吸入性。本实验制备的原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球A、B、C，在喷雾干燥过程中产生的微球表面褶皱结构，一方面减少了微球之间的接触，与表面较光滑的微球相比其粘附力降低，降低了粒子的表面自由能，另一方面具有褶皱结构的微球分散性较少依赖于吸入装置和吸入气流[28]。因此本实验制作的具有表面褶皱结构的原花青素/白芨多糖/壳聚糖具有较好的沉积性能，可以考虑作为肺吸入用药。

载体的作用多为吸附药物粒子，提高粉雾剂的流动性。载体的粒径、载体流动性、载体与药物的比例对于干粉吸入剂都有重要影响。原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球的制备过程中，白芨多糖的剂量对微球特性的影响通过含水率表达。含水率又称吸湿性，通常，吸湿增重可直接反映适度条件对粉体的影响。湿度的增加会影响离子的大小，使粉末聚集，破坏其分散性，影响药物效果[29]，也会影响微球的雾化性能。吸湿性强的药物以粉末形式给药，粒子粒径因聚集或吸收水分而增大，易于在呼吸道截留。由于白芨多糖具有一定的吸湿性，当白芨多糖载体的含量增加时，微球的吸湿性增加，所以得到的微球的吸湿率随着白芨多糖载体的比例增加而增加。原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球C的含水率与白芨多糖/空白D微球相似，说明白芨多糖/壳聚糖微球载药原花青素以后不影响其吸湿特性。 药物的溶解性是影响释放的一个重要因素，难溶的药物释放较慢[30]。微球A在pH6.8易于溶胀，溶胀能力的差异很可能是由于4种微球的处方组成、时间等多种因素造成，4种微球的组成处方中，微球A，B，C 3种处方白芨多糖含量不同，可能是造成这3种微球溶胀率不同的主要因素。粒子的固密度是指密实状态下单位体积粉末的质量，也称为粉末真密度，它表征的是粉末离子本身由于其形态特征所体现出的密度差异。空气动力学径是指相同沉降速度的单位密度球体的粒径。影响粒子在呼吸道沉积的因素很多，包括沉降、扩散、惯性撞击、截留，静电等作用[31]，而其中沉降对粒子在肺部的沉积起主要作用。 文献报道[32]，粒子的密度可以通过固密度估算，约为固密度的1.26倍，通过固密度以及平均粒径的测定结果可以得出粉体的单个粒子所具有的空气动力学径，进而评价微球是否符合肺部粒子吸入的要求。 药物颗粒固密度愈低，其可呼吸比例越高。结果见图2(C)，载体比例不同，固密度值也不同(0.375～0.496)，本实验制的微球从含水率、溶胀率、固密度3个性能来看，微球B结果最符合肺粒子吸入的要求，适合肺部吸入给药，但还存在一些问题有待进一步解决，尤其是在处方设计和给药装置、体外评价方法以及长期安全性评价。

缓释制剂是指用药后能在较长时间内持续释放药物以达到延缓药效目的的制剂。Pandey等[33]制备了利福平、异烟肼和吡嗪酰胺的聚乳酸-乙醇酸(PLGA)纳米粒，给药后释放时间长达11 d，消除半衰期和平均滞留时间显著延长。图3结果所示微球C药物的释放加快，这可能是由于随着药物载体含量的提高，微球膜内外的浓度差加大，导致初始速率加快。张珠[34]用加热固化法制备利福平壳聚糖蛋白微球时发现，药物/载体比例高或低皆可导致药物释放加快，要有药物/载体比例适当，才能获得缓释效果。图3结果所示，微球C同其他3种微球比较，药物/载体比例适当，具有较好的缓释作用，有望成为缓释制剂进一步研究。

综上所述，喷雾干燥法能成功地制备原花青素/白芨多糖/壳聚糖微球，得到的微球粒径均匀、外观圆整表面有褶皱，通过含水率、溶胀率、固密度及体外释放等特性的分析，结果表明微球A、B、C具有较好的含水率、溶胀率、固密度，微球B结果符合肺粒子吸入的要求，但还需进一步改进，微球C具有良好的缓释效果，原花青素/白芨多糖/壳聚糖有望研制成为肺吸入干粉制剂。

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(编校：王冬梅)

Preparation and characterization of proanthocyanidins/ bletilla striata polysaccharide/chitosan microsphere

WANG Da-wei1†, WEN Bao-fang2†, SHANG Hong-Cai3, FENG Zhan-qin4, ZHANG Wei-fen3,4Δ

(1.Department of Traditional Chinese Internal Medicine, Qushan Hospital, Linqu 262600, China; 2.Clinical College, Weifang Medical University, Weifang 261053, China; 3.Beijing Chinese Medicine University, Key Laboratory of Ministry of Education of Chinese Internal Medicine, Beijing Key Laboratory of Chinese Internal Medicine,Beijing 100000, China; 4.College of Pharmacy, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

ObjectiveTo prepare proanthocyanidins/bletilla striata polysaccharide/chitosan microspheres (PC/BSP/CTS)and the physic-chemical characterizations were investigated.MethodsThe PC/BSP/CTS microspheres were prepared by spray drying method.The morphology of PC/BSP/CTS microspheres was observed by Scanning Electron Microscopy(SEM), and its physic-chemical characteristics such as diameters, release in vitro, moisture content, swelling ratio, solid density were studied.ResultsThe PC/BSP/CTS microspheres were successfully prepared by spray drying method, SEM showed that PC/BSP/CTS microspheres had the spherical shape with smooth surfaces.The diameters of microsphere A, B and C were 10～20, 2～15, 10～25 μm.The in-vitro release showed that the cumulative release of three kinds of microspheres A, B, C was 25.07 %, 38.83 % and 60.00 % in 24 h, which had no burst release, while with time prolonged to 48 h, the cumulative release was 28.89%, 43.17% and 72.86%, respectively.The results of moisture content, swelling ratio, solid density were 15.35%～23.51%, 46.50%～105.80%, 0.375～0.496.ConclusionThe PC/BSP/CTS microspheres are successfully prepared by spray drying method which possess good characteristics and sustained-release effect, which would be as a good pulmonary drug delivery system.

proanthocyanidins; bletilla striata polysaccharide; chitosan; spray drying; microshpere; physiochemical properties

国家科技部科技计划项目(2013GA740103)；山东省自然科学基金(ZR2012CM025)；山东省科技攻关项目(2012YD 18063)；山东省潍坊市科技计划项目(2014WS045)

王大卫，男，本科，主治医师，研究方向：中医内科研究，E-mail：shl20100413@sin.cn ；温宝芳，共同第一作者，女，硕士在读，研究方向：药物新剂型与新技术， E-mail:wenbaofang_521@163.com；张维芬，通讯作者，女，博士，硕士生导师，教授，研究方向：药物新剂型与新技术研究， E-mail：zwf2024@126.com。

R735.7

A

1005-1678(2015)07-0133-05