炔基化聚天冬酰胺开环衍生物的合成及生物相容性研究

高红林，韩京华，杨翠红，刘雅洁，宋娜玲Δ，王燕铭Δ

(1.北京协和医学院&中国医学科学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室，天津 300192；2.南开大学 药学院 药物化学生物学国家重点实验室，天津 300071)



炔基化聚天冬酰胺开环衍生物的合成及生物相容性研究

高红林1，韩京华2，杨翠红1，刘雅洁2，宋娜玲1Δ，王燕铭2Δ

(1.北京协和医学院&中国医学科学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室，天津 300192；2.南开大学 药学院 药物化学生物学国家重点实验室，天津 300071)

目的 合成一种新的炔基化聚天冬酰胺-g-苯丙氨酸衍生物用作功能化药物载体。方法 以L-苯丙氨酸为原料制备苯丙氨酸甲酯盐酸盐，对聚琥珀酰亚胺(polyasparamide, PSI)进行开环反应得到聚天冬酰胺-g-苯丙氨酸衍生物PSI-Phe-OMe，使用炔丙胺进一步开环得到炔基化的聚天冬酰胺-g-苯丙氨酸衍生物PSI-Phe-OMe-PA；通过1HNMR进行聚合物结构确证；通过MTT法、显微观察法和碘化丙啶(PI)染色法等确定PSI-Phe-OMe-PA对细胞增殖、形态以及细胞周期的影响。结果1HNMR确证了PSI-Phe-OMe-PA的分子结构，苯丙氨酸甲酯盐酸盐对PSI的开环率为40%，炔丙胺进一步开环后可使开环率接近100%；MTT实验表明PSI-Phe-OMe-PA对NIH 3T3 和HepG2 2种细胞的毒性较小，在浓度为100 μg/mL时细胞存活率仍在80%左右，且对细胞形貌和细胞周期无显著影响。结论 苯丙氨酸甲酯和炔丙胺可依次对聚琥珀酰亚胺进行开环合成炔基化的聚天冬酰胺开环衍生物PSI-Phe-OMe-PA，且PSI-Phe-OMe-PA是一类安全的功能化药物载体。

聚天冬酰胺衍生物；炔基化；药物载体；生物相容性

聚天冬酰胺类材料因具有生物相容性好、可降解和易修饰等优点被认为是一种有应用前景的药物控释材料[1-3]。理想的药物载体需要具备高载药量、可实现药物靶向缓控释等智能响应的特性[4-6]。因此，对传统天然类药物载体材料的生物改性成为必然趋势。采用不同的开环试剂对聚琥珀酰亚胺(polysuccinimide, PSI)进行开环可以使其易于进行功能化修饰，因此可赋予PSI衍生物更加广阔的应用前景。Zhao等[7]设计pH敏感聚天冬酰胺的肼解产物聚天冬酰肼(PAHy)作为阿霉素的载体用作抗肿瘤治疗。Chen等[8]合成了星状聚天冬氨酸-琥珀酰亚胺共聚物纳米载体用于植物韧皮部药物输送。本文旨在利用L-苯丙氨酸甲酯上的氨基和炔丙胺对PSI依次进行开环反应从而构建适于应用的功能化药物载体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：聚琥珀酰亚胺(PSI，实验室自制，粘均分子量为50kDa)；L-天冬氨酸、环丁砜、均三甲苯、L-苯丙氨酸和炔丙胺(Alfa Aesar，美国)；细胞培养耗材(Corning，美国)；胎牛血清、RPMI 1640细胞培养基、胰蛋白酶和3-(4，5)-双甲基-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT，Gibco，美国)；碘化丙啶(Propidium Iodide，PI，Sigma，美国)；其他试剂均购自天津试剂六厂。

1.1.2 细胞株：NIH 3T3(小鼠胚胎成纤维细胞系)和HepG2(人肝癌细胞系)细胞，为本实验室保存。

1.1.3 仪器：电子分析天平(BT124S，Sartorius)；集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S，予华仪器)；旋转蒸发器(SB-1000，东京理化器械)；核磁共振仪(1H NMR，Bruker ARX 400，瑞士)；倒置荧光显微镜(DMI 3000B，Leica，德国)；全波长多功能酶标仪(Varioskan Flash，THERMO，美国)；流式细胞仪(Accuri C6，Accuri Cytometers，美国)。

1.2 方法

1.2.1 化学合成及结构表征

① 苯丙氨酸甲酯盐酸盐(Phe-OMe·HCl)的合成：在0 ℃条件下向40 mL无水甲醇中逐滴加入8.8 mL氯化亚砜，滴加完毕后温度上升至室温，继续搅拌0.5 h，然后缓慢加入L-苯丙氨酸，温度上升至80 ℃，回流反应10 h。反应液冷却后滴入乙醚中得到白色沉淀苯丙氨酸甲酯盐酸盐备用。

② PSI-Phe-OMe的合成：Phe-OMe·HCl的氨基可以对PSI进行开环反应，同时使开环聚合物带有甲酯侧链。取PSI 500 mg溶于5 mL DMF中，加入3.69 g Phe-OMe·HCl，三乙胺2.8 mL，于60 ℃下反应24 h，将反应液冷却后滴入无水乙醚中沉淀，得到淡黄色固体粉末即为聚合物PSI-Phe-OMe。

③ PSI-Phe-OMe-PA的合成：炔基是点击化学的一个重要反应基团，可以与叠氮形成三唑环，该反应易于进行且专属性强，可以在聚合物主链上引入更丰富的基团或侧链。使用炔丙胺与剩余的琥珀酰亚胺单元反应，使炔基连接到聚合物链上。取PSI-Phe-OMe 500 mg溶于5 mL DMF中，缓慢加入炔丙胺 0.13 mL，

40 ℃下搅拌反应96 h。将反应液用5 mL蒸馏水稀释，转入截留分子量为8 kDa的透析带中透析48 h，透析液为蒸馏水。将透析袋中溶液置于冷冻干燥机中冻干，得到淡黄色固体即为目标聚合物PSI-Phe-OMe-PA。聚合物结构表征通过核磁共振氢谱进行测定。

1.2.2 细胞毒性检测：采用MTT法和细胞微观形态观察研究聚合物PSI-Phe-OMe-PA的细胞毒性。NIH 3T3和HepG2细胞，用RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素)在37 ℃，5%CO2的培养箱中培养。MTT实验中按1×104细胞/孔接种96孔板，培养24 h。用含不同浓度聚合物(0、1、2、5、10、100 μg/mL，0 μg/mL为对照组，其余为实验组)的RPMI 1640培养基置换细胞培养液继续培养24 h。按照20 μL/孔向培养液中加入MTT(5 mg/mL)继续培养4 h，加入二甲基亚砜，室温避光震荡裂解10 min后用全波长多功能酶标仪测定OD 490，按照以下公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)= 实验组OD490/对照组OD490×100。

细胞微观形态观察实验中按5×104HepG2细胞/孔接种24孔板，培养24 h。用含聚合物浓度为50 μg/mL的RPMI 1640培养基继续培养24 h后于倒置显微镜下观察。

1.2.3 细胞周期检测：为考察PSI-Phe-OMe-PA对细胞周期的影响，利用碘化丙啶(PI)染色法通过流式细胞仪分析细胞周期的变化。细胞培养方法同1.2.2中细胞微观形态观察法。聚合物(浓度为50 μg/mL,为实验组，以不加聚合物为对照组)孵育24 h后，消化、离心收集细胞后加入500 μL 碘化丙啶染液(PI，50 μg/mL，含100 μg/mL RNase A和0.2%Triton X-100)，4 ℃避光孵育0.5 h，流式细胞仪收集2×104细胞检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行分析，2组间比较进行t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PSI-Phe-OMe-PA合成及结构表征 利用L-苯丙氨酸甲酯上的氨基对PSI进行开环得到聚合物PSI-Phe-OMe，使PSI在开环后带有苯丙氨酸甲酯侧枝，然后使用炔丙胺进行进一步开环反应得到终产物PSI-Phe-OMe-PA。见图1。

图1 苯丙氨酸甲酯(a)和聚合物PSI-Phe-OMe-PA(b)的合成路径Fig.1 Synthetic routes of L-phenylalanine methyl ester hydrochloride (a) and target compound PSI-Phe-OMe-PA (b)

核磁共振氢谱显示聚合物PSI-Phe-OMe-PA的结构是正确的。见图2。4.44 ppm和3.82 ppm处的信号峰为炔丙胺特征峰，同时5.29 ppm处环上亚甲基特征峰仅有少量残留，说明反应接近完全，即炔丙胺使剩余的琥珀酰亚胺环完全打开。7.20 ppm处苯环峰和3.82 ppm处甲基峰显示苯丙氨酸甲酯结构完好。采用内标法磁氢谱计算其开环率约为40%。

图2 PSI-Phe-OMe-PA的1H核磁表征Fig.2 1H NMR spectrum of PSI-Phe-OMe-PA

2.2 细胞相容性分析 目标聚合物PSI-Phe-OMe-PA用作药物载体对细胞毒性以及对细胞周期的影响结果显示：随着聚合物浓度的增加，细胞存活率有一定的下降，但在聚合物浓度<100 μg/mL时2种细胞的存活率仍在80%左右。见图3。与对照组相比，50 μg/mL的聚合物处理24 h对HepG2细胞的微观形貌没有产生明显影响。见图4。50 μg/mL聚合物对于NIH 3T3细胞和HepG2细胞的细胞周期分布无显著影响。见图5。

图3 PSI-Phe-OMe-PA处理24 h对NIH 3T3细胞和HepG2细胞的毒性Fig.3 Toxicity of PSI-Phe-OMe-PA on NIH 3T3 celland HepG2 cell for 24 hours

图4 HepG2细胞的形貌观察A:HepG2对照细胞；B:PSI-Phe-OMe-PA (50 μg/mL)处理24 h的HepG2细胞标尺均为50 μmFig.4 Morphology of HepG2 cell treated with PSI-Phe-OMe-PA for 24 hoursA:control(0 μg/mL);B:treated with PSI-Phe-OMe-PA(50 μg/mL)All scale bars were 50 μm

图5 PSI-Phe-OMe-PA(50 μg/mL)处理24 h对NIH 3T3细胞(A)和HepG2细胞(B)细胞周期的影响Fig.5 Effect of PSI-Phe-OMe-PA (50 μg/mL) on cell cycles of NIH 3T3 cell(A) and HepG2 cell(B) for 24 hours

3 讨论

聚琥珀酰亚胺(PSI)是通过L-天冬氨酸热缩聚合而成，易在碱性条件下水解成天冬氨酸聚合物或水凝胶，或通过亲水性氨基等功能基团修饰形成水溶性好、生物相容性高的聚天冬氨酸衍生物。PSI及其衍生物的这种碱性响应性、生物可降解性以及易于进行功能化修饰的特性使其在药物控释领域显示出广阔的应用前景[9-10]。本文采用L-苯丙氨酸甲酯对PSI进行开环，一方面L-苯丙氨酸甲酯的氨基可以打开一部分PSI的琥珀酰亚胺单元，另一方面，L-苯丙氨酸结构的苯环可与含苯环的药物分子如布洛芬、环丙沙星等形成π-π共轭作用[11]，从而增大聚合物的载药能力。磁共振氢谱结果显示L-苯丙氨酸甲酯对PSI的开环率约为40%，为后续作为药物载体应用奠定了结构基础。

点击化学(Click chemistry)已经成为目前最吸引人的合成理念之一，因点击化学反应专一性强、可调控强，已广泛用于生物医用材料和药物研发等领域[12-13]。本文利用炔丙胺对PSI进行进一步开环反应，在苯丙氨酸甲酯结构完整的前提下可基本完全打开PSI-Phe-OMe中的琥珀酰亚胺环得到炔基化的聚天冬酰胺-g-苯丙氨酸衍生物。炔基化可赋予聚合物载体通过点击化学连接其他功能基团的特性，如可连接亲水基团聚乙二醇(PEG)，使聚合物具有两亲性，能够更好地形成载药纳米颗粒并在水相中维持稳定的结构等[14]。

药物载体的生物性能对于其能否用于体内药物输送具有重要的意义[15]。细胞毒性和细胞周期评价显示通过L-苯丙氨酸甲酯和炔丙胺两步开环反应得到的炔基化聚天冬酰胺开环衍生物PSI-Phe-OMe-PA具有良好的细胞相容性，是一种潜在的功能化药物载体。

[1] Gyarmati B,Mészár EZ,Kiss L,et al.Supermacroporous chemically cross-linked poly(aspartic acid) hydrogels [J].Acta Biomater,2015,22:32-38.

[2] Zhao D,Li B,Han J,et al.PH responsive polypeptide based polymeric micelles for anticancer drug delivery [J].J Biomed Mater Res A,2015,103(9):3045-5303.

[3] 赵彦生，袁广薇，马兴吉，等.聚天冬氨酸的改性及其应用研究进展[J].化学与生物工程，2009，26(6)：15-18.

[4] Liu J,Liu J,Chu L,et al.Self-assembling peptide of D-amino acids boosts selectivity and antitumor efficacy of 10-hydroxycamptothecin[J].ACS Appl Mater Interfaces,2014,6(8):5558-5565.

[5] 林潇，唐明灯.靶向表皮生长因子受体分子探针研究进展[J].国际放射医学核医学杂志，2015，39(1)：85-90.

[6] 杨翠红，张玉民，刘金剑，等.RGD 功能化多肽纳米纤维的制备及其体内肿瘤靶向性研究[J].中国生化药物杂志，2014，34(5)：5-8.

[7] Zhao D,Li B,Han J,et al.PH responsive polypeptide based polymeric micelles for anticancer drug delivery [J].J Biomed Mater Res A,2015,103(9):3045-3053.

[8] Chen M,Jensen SP,Hill MR,et al.Synthesis of amphiphilic polysuccinimide star copolymers for responsive delivery in plants[J].Chem Commun (Camb),2015,51(47):9694-9697.

[9] Hill MR,MacKrell EJ,Forsthoefel CP,et al.Biodegradable and pH-responsive nanoparticles designed for site-specific delivery in agriculture[J].Biomacromolecules,2015,16(4):1276-8122.

[10] Yang HM,Park CW,Woo MA,et al.HER2/neu antibody conjugated poly(amino acid)-coated iron oxide nanoparticles for breast cancer MR imaging [J].Biomacromolecules,2010,11(11):2866-2872.

[11] Janiak C.A critical account on π-π stacking in metal complexes with aromatic nitrogen-containing ligands [J].J Chen Soc, Dalton Trans,2000(21):3885-3896.

[12] Musumeci F,Schenone S1,Desogus A,et al.Click chemistry, a potent tool in medicinal sciences[J].Curr Med Chem,2015,22(17):2022-2050.

[13] 王红梅，王蔺，王晓川.点击反应在功能材料中的应用[J].材料导报A，2014，28(8)：130-135.

[14] Lv S,Song W,Tang Z,et al.Charge-conversional PEG-polypeptide polyionic complex nanoparticles from simple blending of a pair of oppositely charged block copolymers as an intelligent vehicle for efficient antitumor drug delivery [J].mol Pharm,2014,11(5):1562-1574.

[15] 杨翠红，韩京华，刘金剑，等.聚天冬酰胺衍生物的合成及细胞毒性研究[J].天津医药，2015，43(6)：582-586.

(编校：吴茜)

Synthesis and biocompatibility of ethynylated open ring derivatives of polyasparamide

GAO Hong-lin1, HAN Jing-hua2, YANG Cui-hong1, LIU Ya-jie2, SONG Na-ling1Δ, WANG Yan-ming2Δ

(1.Tianjin Key laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine, Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Tianjin 300192, China; 2.State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Pharmacy, Nankai University, Tianjin 300071, China)

ObjectiveTo synthesize a new ethynylated open ring derivatives of polyasparamide as functional drug carrier.MethodsL-phenylalanine methyl ester hydrochloride was prepared using L-phenylalanine and then was used for ring opening reaction of polysuccinimide.To synthesize the target product of PSI-Phe-OMe-PA, the obtained polyasparamide-g-phenylalanine derivatives (PSI-Phe-OMe) was further ring opened by propargylamine.The structure of PSI-Phe-OMe-PA was confirmed by1H NMR.The biocompatibility of PSI-Phe-OMe-PA was evaluated by MTT method, inverted microscope observation and cell cycles analysis (propidium iodide staining).ResultsThe ring-opening rate of polyasparamide by L-phenylalanine methyl ester and propargylamine was 40%and 100%, respectively.All results of biocompatibility studies indicated that PSI-Phe-OMe-PA may be a good candidate for functional drug carrier.Conclusion Based on the ring-opening capability of amino-group and the specificity of click reaction, L-phenylalanine methyl ester hydrochloride and propargylamine were used successively to react with polyasparamide.PSI-Phe-OMe-PA is a biocompatible functional drug carrier.

derivatives of polyasparamide; ethynylation; drug carrier; biocompatibility

国家自然科学(51473080)；天津市应用基础与前沿技术研究计划(14JCZDJC33300)；北京协和医学院“协和青年基金”(3332015100)；国家自然科学基金 青年科学基金(51303213)；中国医学科学院放射医学研究所基金(所探1550)

高红林，女，硕士，研究方向：药物载体材料的设计及生物性能研究，E-mail:mwtghl@163.com；宋娜玲，通讯作者，女，副研究员，硕士生导师，研究方向：蛋白质分析和核酸分析的新技术、新方法和新试剂的研究以及生物医用材料的设计等，E-mail：nalingsong@sina.com；王燕铭，共同通讯作者，男，博士，副教授，研究方向：功能性高分子材料和杂化材料的化学生物学性质以及药物和基因控释研究，E-mail：wangyanming@nankai.edu.cn。

R914.5

A

1005-1678(2015)09-0001-04