正交试验优选无糖润肺颗粒醇提取工艺

沈丽娟，杨鑫骥，杜静，何艳,傅应华Δ

(1.浙江莎普爱思药业股份有限公司，浙江 平湖 314200；2.嘉兴学院 医学院药学系，浙江 嘉兴 314001；3.杭州市红十字会医院药剂科， 浙江 杭州 310009)



正交试验优选无糖润肺颗粒醇提取工艺

沈丽娟1，杨鑫骥2，杜静3，何艳2,傅应华2Δ

(1.浙江莎普爱思药业股份有限公司，浙江 平湖 314200；2.嘉兴学院 医学院药学系，浙江 嘉兴 314001；3.杭州市红十字会医院药剂科， 浙江 杭州 310009)

目的 优化无糖润肺颗粒剂的醇提取生产工艺。方法 采用3个不同比例的乙醇水作溶剂，选择4因素3水平正交表L9(34)进行试验，对处方中9味中药的醇溶性成分进行提取，以黄芩苷含量和干浸膏得率2者加权之和为定量指标，对影响醇提取效率的4个因素3个水平进行考察。结果 醇溶性成分提取最优条件为：取9味中药先用10倍量70%乙醇浸泡45 min，再加热回流提取3次，每次1.5 h。结论 本法可最大限度提取处方中9味中药的醇溶性成分，可作为润肺颗粒剂的醇提取生产工艺。

无糖润肺颗粒剂；醇提工艺优化；正交试验；黄芩苷

无糖润肺颗粒剂是依据杭州市红十字会医院润肺合剂处方(院内协定处方)经现代制备工艺研制而成的一个纯中药的固体制剂。其处方由桔梗、甘草、黄芩、麦冬等9味中药组成，具有养阴润肺、凉血解毒的功效。临床上用于系统性红斑狼疮患者，可以降低疾病复发和使用糖皮质类激素药物、免疫抑制剂引起的毒副作用，在减少患者抗菌药物用量、降低感染发生率方面疗效显著。由于原合剂用传统中药水煎煮方法制备而成，使大量醇溶性有效成分丢失，影响制剂的疗效。为了最大限度获取有效成分，保证无糖润肺颗粒剂质量稳定可控，本文对处方中9味中药采用乙醇提取，利用正交试验法对醇提取工艺进行优化。黄芩是处方中君药之一，黄芩苷是其主要有效成分，含量也较高。因此以黄芩的有效成分黄芩苷为考察指标，参考文献[1-5]建立了高效液相色谱法测定无糖润肺颗粒剂醇提干浸膏中黄芩苷含量的方法， 并以黄芩苷含量与醇提干浸膏得率加权之和为评判指标，筛选出无糖润肺颗粒剂9味中药的最佳醇提取工艺条件，以期为实际生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器：高效液相色谱仪，由P680低压四元泵，UVD170U紫外-可见检测器，ASI-100自动进样器，TCC-100柱温箱，Chromeleon色谱数据工作站组成(美国Dionex公司)；电子天平(Mettler Toledo公司)。

1.1.2 药品与试剂：黄芩苷对照品(批号：110715-201117，含量为91.7%，使用前无需干燥，购自中国食品药品检定研究院)；桔梗、甘草、黄芩、麦冬等9味中药购自杭州桐君堂医药药材有限公司中药饮片厂，经嘉兴市食品药品检验检测院朱山寅主任中药师鉴定均为正品；缺黄芩的8味中药醇提对照空白样品溶液1批(自制)。乙醇为药用规格(浓度95%)，甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 黄芩苷含量测定方法的建立

① 检测波长的选择：取黄芩苷对照品适量，用甲醇溶解并定量稀释至浓度约为10 μg/mL的溶液，于岛津UV-2501PC紫外分光光度计上在200 ～ 400 nm波长范围内进行扫描。

② 色谱条件及系统适用性试验方法：试验了3种不同极性的反相C18色谱柱，包括Ailgent Zorbax SB-C18柱、依利特Krisomail-C18柱和Ailgent Zorbax Extend-C18柱，2种不同流动相系统包括甲醇-水、乙腈-水系统及添加少量磷酸，3种不同流速为0.5、1.0、1.5 mL/min，对色谱条件进行反复试验，理论塔板数按黄芩苷峰计算。

③ 样品测定：精密量取正交试验27份样品溶液，振摇均匀，再精密量取1 mL，分别置25 mL量瓶中，加甲醇约20 mL，超声溶解10 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；另精密称取黄芩苷对照品适量，用甲醇溶解并准确稀释成含黄芩苷90.0 μg/mL的溶液，作为对照品溶液。分别注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，按外标法以峰面积计算样品中黄芩苷含量。

④ 线性关系考察：精密称取黄芩苷对照品10.60 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积(Y)对黄芩苷对照品浓度(X，μg/mL)绘制标准曲线，进行线性回归。

⑤ 进样精密度试验：精密称取黄芩苷对照品适量，用甲醇溶解并定量稀释至浓度约为90.0 μg/mL的溶液，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，重复进样6次，测定峰面积。

⑥ 重复性试验：取同一份正交试验样品，振摇均匀，再精密量取1 mL，置25 mL量瓶中，共5份，按“③样品测定项下” 方法制备供试品溶液，同法测定黄芩苷含量。

⑦ 溶液稳定性试验：取同一份供试品溶液，在0、2、8、12、24 h内取样测定黄芩苷峰面积。

⑧ 加样回收率试验：取同一份已知含量的正交试验样品(黄芩苷含量为2.245 mg/mL)，振摇均匀，再精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，共9份，分3组，每组3份，各精密加入黄芩苷对照品溶液(含黄芩苷2.206 mg/mL)0.8、1、1.2 mL，按“③样品测定项下” 方法制备供试品溶液，同法测定黄芩苷含量，计算低、中、高3个浓度的加样回收率。

⑨ 专属性试验：取缺黄芩的醇提对照空白样品溶液适量，按“③样品测定项下” 方法用甲醇稀释至与供试品溶液浓度相当的溶液，作为阴性对照溶液，进样10 μL；另取“③样品测定项下” 制备的供试品溶液与黄芩苷对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

1.2.2 正交试验的试验方法

① 浸泡时间的优选：按处方比例准确称取上述9味中药各3份，每份16.4 g，分别加入10倍量50%、60%、70%乙醇，各浸泡30、45、60、75 min，抽滤净药材表面可流动溶剂，准确称重。

② 正交试验设计：应用正交设计的科学实验设计方法，本文选定试验因素为4，即不同浓度乙醇(A)、不同溶剂倍数(B)、不同提取时间(C)和不同提取次数(D)；各因素取3水平(表1)，按L9(34)正交表进行筛选[6]。根据正交试验表进行试验，对处方中9味中药中的醇溶性有效成分进行提取。见表1。

表1 正交试验的因素和水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment design

③ 试验方法：按处方比例准确称取上述9味中药饮片，每份16.4 g，共27份，置1000 mL磨口烧瓶中，连接冷凝管加热回流提取，按L9(34)正交试验表进行试验。每份样品在第一次加热回流提取前均先浸泡45 min，经不同时间、次数提取后，放冷，收集提取液，先经减压蒸馏回收乙醇，再将内容物转移至50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

④ 干浸膏量的测定[1]：按照《中国药典》2010年版一部干燥失重法，精密吸取浓缩液25 mL，置已经105 ℃干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥至恒重，计算干浸膏重量，再乘以2即为每份样品所得醇提干浸膏的重量。

2 结果

2.1 黄芩苷含量测定结果

2.1.1 检测波长的确定：确定最大吸收波长为280 nm。

2.1.2 色谱条件及系统适用性试验结果：色谱柱：Krisomail-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水-磷酸(53︰47 ︰0.1)；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃。理论板数按黄芩苷峰计算应大于3500，黄芩苷峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.5。

2.1.3 专属性试验结果：在供试品溶液色谱图中，呈现与黄芩苷对照品色谱保留时间(7.286 min)一致的色谱峰，阴性对照溶液未出现与对照品色谱保留时间一致的色谱峰，表明阴性对照溶液不干扰供试品溶液中黄芩苷的定量测定，方法专属性好。见图1。

图1 对照品溶液(A)、供试品溶液(B)和阴性对照溶液(C)的高效液相色谱图1 .黄芩苷Fig.1 HPLC chromatogram of standard solution(A), sample solution(B) and negative solution(C)1.Baicalin

2.1.4 线性关系考察结果：以峰面积(Y)对黄芩苷对照品浓度(X)进行线性回归，得回归方程为Y=0.5302X-0.9120，r=0.9997。结果表明，黄芩苷峰面积与浓度在19.5～195.0 μg/mL之间呈良好线性关系。

2.1.5 精密度试验结果：计算6次进样黄芩苷峰面积的RSD=0.22%。表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性测定结果：计算6份样品中黄芩苷含量分别为2.263、2.180、2.258、2.194、2.275、2.301 mg/mL，平均含量为2.245 mg/mL，RSD=2.12%。表明方法重复性良好。

2.1.7 溶液稳定性试验结果：对同一份供试液中黄芩苷测定其峰面积基本不变，表明溶液在24 h内稳定。

2.1.8 加样回收率试验结果：回收率试验结果见表2，低、中、高3个浓度加样回收率分别为95.0%，100.9%，102.2%，平均为99.4%。表明本法回收率良好。见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=3)Tab.2 Results of recovery test from sample(n=3)

2.2 正交试验的试验结果

2.2.1 浸泡时间的确定：经3种不同浓度乙醇浸泡45 min后，药材重量均不再增加，故确定浸泡时间为45 min。

2.2.2 正交试验结果与方差分析:采用综合评分法分析试验结果，计算公式为

计算结果见表3，方差分析见表4。

表3 L9(34)正交试验结果(n=3)Tab.3 Optimization test results of L9(34)(n=3)

*评判指标(%)=黄芩苷含量×10×60%+浸膏得率×40%*Assessment index (%)=baicalin content×10×60%+extract quantity×40%

表4 正交试验方差分析表Tab.4 Variance analysis table of optimization test

F0.05(2,18)=6.01，F0.01(2,18)=3.55

由正交试验结果和方差分析表可以看出，影响醇溶性成分提取的最大因素为提取次数，次序为D>B>C>A。通过比较各因素的均值，由直观分析得醇提取最佳工艺为A3B3C2D3，即取9味中药用10倍量70%乙醇浸泡45 min，再加热回流提取3次，每次1.5 h。由于该实验条件在正交试验中没有出现，因此按照这个条件进行验证试验。取9味中药各3份，每份65.6 g，按确定的最佳提取条件操作，合并提取液，回收乙醇，浓缩后干燥，得3批干浸膏，按上述给定的色谱条件测定黄芩苷含量，得3批浸膏的黄芩苷平均含量为2.05%，RSD=3.68%；干浸膏平均得率为44.51%，RSD=3.24%，评判指标为29.92%，达到了最大提取效果。表明该工艺稳定，可用于工业化生产。

3 讨论

无糖润肺颗粒处方中9味中药均含有醇溶性成分，其中黄芩含有黄芩苷等；天冬含β-谷甾醇、菝葜皂苷元、薯蓣皂苷元等[7]，麦冬含甾体皂苷、黄酮类[8]，玄参主要含有环烯醚萜类、苯丙素苷、糖类、肉桂酸、皂苷[9]等；桔梗主要含有皂苷类、远志酸类，甾醇类等[10]，半夏主要成分为生物碱、β-谷甾醇、多糖、半夏蛋白、氨基酸、挥发油及无机元素等多种化学成分；枳壳主要含有黄酮类化合物、挥发油和少量的生物碱等成分[11]；淡竹叶含有黄酮类，用乙醇可以提取更完全。原合剂工艺采用加水煎煮，提取效率低，造成大量有效成分丢失。为此，改进的颗粒剂提取工艺将药材先用70%乙醇提取，其药渣加水煎煮提取水溶性成分，大大提高了有效成分的提取量，制成的颗粒剂质量更稳定，为新药的开发与药效学再评价提供更好的剂型。由表3可见，干浸膏中黄芩苷平均含量在1.59%～2.18%，干浸膏平均得率在25.37%～47.37%之间，2者差异较大。如果不增加黄芩苷含量的权重，直接与干浸膏得率进行计算，所得结果主要反映干浸膏得率的变化。为此，本实验采取增加黄芩苷含量权重的方法，即通过将黄芩苷含量乘以10，再按照黄芩苷含量︰干浸膏得率(60︰40)进行计算，得到的评判指标可充分反映黄芩苷含量与干浸膏得率2者的量，这样得到的醇溶性成分既可获得较高的黄芩苷含量，又可增加干浸膏的得率，可改进制剂质量，提高疗效。由于本处方的出膏率为44.5%，一次服用量即使在不加辅料情况下也很难制备成片剂或胶囊剂，故选择制备成颗粒剂。

[1] 中国药典.中2010[S].一部.附录 51，282.

[2] 傅应华，徐宏祥.消瘰合剂的质量控制项目研究[J].药物分析杂志，2010，30(3)：526-529.

[3] 方季惟，张红玉，黄国柱，等.消瘰颗粒醇提干浸膏中黄芩苷含量的HPLC法测定[J].嘉兴学院学报，2013，25(6)：117-120.

[4] 王洛临，施之琪，李智勇，等.黄芩解毒颗粒提取工艺研究[J].中成药，2012，34(10)：2028-2031.

[5] 汪燕，陈伟民，何艳，等.正交试验设计优化消瘰颗粒剂醇提取工艺的研究[J].中国药师，2014，17(9)：1486-1488.

[6] 王仁安.医学实验设计与统计分析[M].北京：北京医科大学出版社，2000：47-60.

[7] 徐从立，陈海生，谭兴起，等.中药天冬的化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2005，17(2)：128-130.

[8] 张义萍，陈建真，敖志辉.麦冬不同种属、产地和部位的活性成分研究进展[J].中国实用医药，2008，3(10)：191-193.

[9] 李媛，宋宝安，杨松，等.中草药玄参化学成分的研究[J].天然产物研究与开发，2012，24(1)：47-51.

[10] 郭丽，张村，李丽，等.中药桔梗的研究进展[J].中国中药杂志，2007，31(3)：181-185.

[11] 罗小泉，杨武亮，周至明，等.中药枳壳药材的研究概况[J].江西中医学院学报， 2006， 18(2)：45-47.

(编校：王冬梅)

Optimizing ethanol extraction technology for no sugar runfei granules by orthogonal experiment design

SHEN Li-juan1, YANG Xing-ji2, DU Jing3, HE Yan2, FU Ying-hua2Δ

(1.Zhejiang Shapuaisi Pharmaceutical Co.Ltd., Pinghu 314200, China; 2.Department of Pharmacy, College of Medicine, Jiaxing University, Jiaxing 314001, China; 3.Department of Pharmacy, Hangzhou Red Cross Hospital, Hangzhou 310009, China)

ObjectiveTo optimize ethonal extraction technology for no sugar runfei granules.MethodsEthanol was used as a solvent to extract the ethanol dissolvable ingredients in 9 kinds of medicinal materials.The formula L9(34) table was used to examine the effects of 4 factors and 3 levels.The weighted sum of baicalin content and the dried extract quantity was used as quantitative index.ResultsThe maximize optimize condition for extraction of ethanol dissolvable ingredients was as follows: 9 kinds of medicinal materials, add of 10-fold 70% ethanol solution, soaked for 45 min, and extracted by heating reflux for 3 times,1.5 h each time.ConclusionThe method can maximize extraction of ethanol dissolvable effective ingredents in 9 kinds of medicinal materials and can be used as ethonal extraction technologgary of no sugar runfei granules.

no sugar runfei granules; ethanol extraction technology optimization; orthogonal experiment; baicalin

嘉兴学院重点大学生研究训练计划(NO.851714071)

沈丽娟，女，本科，工程师，研究方向：药物制剂与质量控制，E-mail:947859149@qq.com；傅应华，通讯作者，女，本科，教授，研究方向：药物制剂与质量控制，E-mail:yaoji6217@ sohu.com。

R944.27

A

1005-1678(2015)09-0158-04