草菇菌种退化相关分子标记的筛选

李丹青，王 杰

(华南农业大学 食品学院，广东 广州 510640)

草菇菌种退化相关分子标记的筛选

李丹青，王 杰

(华南农业大学 食品学院，广东 广州 510640)

【目的】 基于SRAP分子标记技术，筛选出与草菇(Volvariellavolvacea)菌丝退化性状紧密连锁的分子标记,为进一步研究目标性状基因的克隆与功能奠定基础。【方法】 以草菇正常生长菌株V51(对照)与其菌丝退化菌株(VNM1～10)为材料，采用群体分离分析法分别构建2种草菇的近等基因池。利用SRAP分子标记技术，寻找两类菌株的差异片段，回收差异片段后与pMD-18T载体连接，构建重组质粒pMD-VNMDF并转化E.coliDH5α感受态细胞，将筛选的阳性克隆测序。根据差异片段序列设计引物，将其转化成SCAR分子标记，并对草菇正常菌株V51及其菌丝退化菌株VNM进行扩增试验，验证该标记的真实性和可靠性。【结果】 81对SRAP引物组合中有2对引物可扩增出稳定差异条带，其中引物对Me8-Em4 PCR扩增出长度约300 bp的差异条带(命名为VNMDF)存在于退化菌株中。对SRAP分子标记片段VNMDF回收、测序并进行序列分析发现，该片段长度为279 bp，其核酸、氨基酸序列与编码26S蛋白酶体亚基的相似性分别达到81%和93%。利用SCAR特异引物对SCAR250可在菌丝退化菌株中稳定扩增出长度约250 bp片段，与预期大小(279 bp)一致，而在正常菌株中未扩增出此片段。【结论】 获得了1条可能与草菇菌丝退化性状基因紧密连锁的SRAP分子标记，并将其成功转化为SCAR标记(SCAR250)。

草菇；菌种退化；SRAP；SCAR

草菇(Volvariellavolvacea)是世界产量第五的重要食用菌，也是我国主要出口菇类之一。草菇品质鲜嫩，味道鲜美，营养丰富，食药兼用，在国内外素享盛名，素有“中国蘑菇”之称[1]。同其他食用菌相比，草菇具有其独特的优势，生长周期短，从播种到收获只要10 d左右[2]。而且，发展草菇产业有利于农业生态的良性循环。因此，草菇是极具发展潜力的食用菌种类。

然而在草菇的生产实践中，一个优良的菌种使用一段时间或继代培养几代后就会发生退化，严重的菌种退化现象制约了草菇产业化开发。菌种退化是菌类栽培过程中普遍存在的现象，也是生产当中迫切希望得到解决的问题。退化菌种在外部形态上表现为菌丝细弱，气生菌丝稀疏，菌丝生长缓慢，容易被杂菌污染；生产上表现为出菇期推迟，成菇数目减少，出菇不整齐，产量下降等[3]。病毒、细菌通过潜伏感染或与菌丝体共生干扰细胞内正常的代谢活动可引起菌种退化[4]。此外，不良环境条件，如紫外线引起DNA中碱基错配等，也可造成菌种退化[5]。

到目前为止，尽管关于食用菌菌种退化的研究取得了一定的进展，但主要集中于导致退化的环境因素分析及利用有性循环、原生质体融合和遗传工程等途径进行菌株改良等方面，且这些研究主要是通过菌种的提纯复壮以及组织或单孢分离选育新菌种[6-8]。对菌种退化机制的研究仅有关于双孢蘑菇染色体非正常性突变[9]以及退化蛹虫草株DNA水平上发生突变[10]的报道。目前尚未见到对退化草菇菌种遗传分析或草菇菌种退化机制的研究报道。

随着分子生物学的发展，利用分子标记分析生物的系统进化、遗传变异、基因定位、分离与克隆等已成为近年来研究的热点。自从1992年Khush等[11]首次报道用PCR技术构建双孢蘑菇的分子标记以来，RAPD、AFLP、ISSR、SCAR等分子标记技术被相继应用于双孢蘑菇[12-14]、香菇[15-17]、草菇[18-19]、金针菇[20]、银耳[21]、黑木耳[22-23]等领域的研究中，在食用菌的遗传育种、菌种和菌株鉴定、遗传多样性分析、基因定位和克隆等方面发挥了巨大作用，极大地提升了食用菌的基础和应用研究水平，为这一领域研究的深入和拓展展现了光明的前景。

SRAP(Sequence related amplified polymorphism)技术是通过独特的引物设计对开放阅读框进行扩增，检测简单，重复性好，具有较高的多态性水平，能够比较容易地分离目的标记并测序，并且无需事先了解基因组序列信息，具有操作简便、快速、仅需微量DNA等特点，因而被广泛应用于遗传多样性研究[24-25]和种质资源的鉴定[26]。Paran等[27]发明了序列特征性扩增区域(Sequence-characterized amplification region，SCAR)分子标记技术，它最初是从RAPD分子标记技术衍生而来，对于依靠AFLP以及SRAP等技术获得的多态性片段也可应用。与SRAP相比，SCAR标记无需在样品鉴定时筛选大量的引物，特异性更强，一般表现为扩增片段的有无，适用于大量个体的快速检测，在实际应用中，具有快速、简便和低成本的优越性。但至今尚未见到将SRAP和SCAR分子标记技术应用于草菇菌种退化研究方面的报道。本研究拟以现有的菌丝退化草菇菌株与其菌丝正常菌株为试验材料，采用群体分离分析法(Bulked segregation analysis，BAS)[28]开展草菇菌种退化的SRAP分子标记研究，对所获得的基因片段进行分析验证，从中筛选出与退化性状基因紧密连锁的分子标记，以期为进一步研究目标性状基因的克隆与功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 草菇V51正常菌株(对照)及其菌丝退化菌株VNM1～10，为华南农业大学食品学院生物炼制实验室保存。

1.1.2 引 物 SRAP引物设计、筛选参考Li等[29]的方法，从其所用引物中随机选取9个上游引物和9个下游引物组合，共81对引物(表1)。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 本研究中所用的SRAP引物组合Table 1 SRAP primer pairs in this study

1.2 方 法

1.2.1 基因组DNA的提取和DNA池的构建 将草菇正常菌株及其菌丝退化菌株母种从试管接种到PDA固体培养基上，于32 ℃恒温培养3～5 d，待菌丝长满平板，保证足够量的菌丝用于基因组DNA提取。草菇基因组DNA的提取按照王艺红等[30]的FDEB法。参照Altinkut等[28]的群体分离分析方法，取对照菌株V51 200 μL基因组DNA，构建DNA池1；取VNM1～10基因组DNA各20 μL等量混合，构建DNA池2，用于筛选特异性标记。

1.2.2 SRAP-PCR反应体系及扩增程序 25 μL SRAP-PCR反应体系中，含dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，基因组DNA (50 ng/μL)1.0 μL，上游引物(10 μmol/L)1.5 μL，下游引物(10 μmol/L)1.5 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL，10×PCR buffer(含20 mmol/L Mg2+)2.5 μL，其余为双蒸水。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，32个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶(含EB)电泳分离，电泳后经电泳凝胶成像系统(BIO-RAD公司)成像检测。

1.2.3 差异片段克隆及序列测定 参照DNA纯化回收试剂盒(TIANGEN公司)说明书回收PCR产物差异片段。将回收产物与pMD18-T载体连接，构建重组质粒，重组质粒命名为pMD-VNMDF，将其转化E.coliDH5α感受态细胞，筛选的阳性克隆送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。测序结果在GenBank中进行BLASTN和BLASTX搜索并进行分析。

1.2.4 SRAP标记转化为SCAR标记 SRAP分子标记虽具有较高的多态性水平，但是特异性较差，限制了其实际生产应用。而SCAR标记特异性更强，更为实用。因此，本研究根据获得的SRAP差异片段序列，用软件Primer 5.0设计SCAR特异引物。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。用设计的SCAR特异引物对草菇正常菌株V51及其菌丝退化菌株进行扩增，确认建立的SCAR 标记的真实性和可靠性。PCR反应的退火温度调整为58 ℃，其他同SRAP-PCR一致。

2 结果与分析

2.1 草菇基因组DNA的提取

提取菌丝生长退化草菇菌株VNM以及对照草菇菌株V51(图1)的基因组DNA，凝胶电泳检测结果表明，DNA纯度较高，结构完整，带型整齐一致，无明显降解现象(图2)，因此可以用于进一步构建DNA池和SRAP分析。

2.2 草菇SRAP标记的筛选

用81对SRAP引物组合对菌丝退化草菇菌株VNM和菌丝正常对照菌株V51的基因组DNA进行扩增，发现大部分引物组合都有扩增条带，片段长度在50～2 000 bp，平均每对引物组合可扩增出约25条清晰的条带(图3)。大部分引物组合在2种菌株间扩增图谱相同。经3次重复后，有2对引物在2种菌株基因组DNA间存在稳定的差异，分别是Me8-Em2、Me8-Em4，扩增除了明显的差异条带，其中仅Me8-Em4在菌丝退化菌株中多出1条特异条带，大小约为300 bp(图4)，经多次重复验证，该差异条带表现稳定。

图2 草菇菌株基因组DNA的电泳检测结果(部分结果)M.Marker 3；1.V51；2～9.VNM1～8Fig.2 Agarose gel analysis of genomic DNA (part) of Volvariella volvacea strainsM.Marker 3；1.V51；2-9.VNM1-8

图3 基于81对 SRAP 引物的草菇基因组PCR扩增结果(部分结果)M.Marker 3；1.V51；2～6.VNMFig.3 PCR amplification product of SRAP (part) of Volvariella volvacea strainsM.Marker 3；1.V51；2-6.VNM

2.3 草菇退化相关差异片段的克隆及测序

将扩增得到的差异片段与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMD-VNMDF转化E.coliDH5α感受态细胞，筛选的阳性克隆委托上海美吉生物医药科技有限公司测序。测序结果(图5)显示，所得片段长度为279 bp，将其命名为VNMDF。在GenBank中进行BLASTN搜索，结果显示，所得序列与MoniliophthoraroreriMCA 2997 26S蛋白酶体亚基ATPase 3部分mRNA序列(GenBank登录号为XM_007846773.1)的相似性为81%，E期望值都为2×10-25；BLASTX搜索结果显示，所得序列与禾柄锈菌(Pucciniagraminis)26S蛋白酶调节亚基6A的氨基酸序列(GenBank登录号为XP_003329145.1)和污叉丝孔菌(Dichomitussqualens)26S蛋白酶体亚基P45的氨基酸序列(GenBank登录号为XP_007366306.1)相似性都为93%，E期望值都为4×10-28。由此推测， VNMDF很可能与编码26S蛋白酶体亚基相关。

图5 草菇特异遗传标记VNMDF的序列下划线处为SCAR250引物对序列Fig.5 Nucleotide sequence of the specific genetic marker VNMDF of Volvariella volvacea strains Underlined is sequence of SCAR250 primer

2.4 草菇SCAR标记的筛选

根据SRAP扩增的特异片段VNMDF的测序结果(GenBank登录号：KJ935906)，设计SCAR特异引物对SCAR250(SCAR250-F：5′-CAAACCGGACCGGAGGAGGG-3′，SCAR250-R：5′-TCTTC-ATTGATGAGCTGGAT-3′)，对草菇菌丝退化菌株与对照菌株基因池进行扩增，结果在菌丝退化草菇菌株基因池中扩增出长度约为250 bp的单一条带，而在对照菌株基因池中未扩增出条带。对8个菌丝退化菌株与4个对照菌株进行扩增检测，结果显示，该引物对在草菇菌丝退化单株中扩增出1条稳定的特异条带，长度大约为250 bp，与预期片段大小(279 bp)一致，而对照菌株中均未扩增出相应的条带(图6)，表明已成功将该SRAP标记转化为SCAR标记，将其命名为SCAR250。由于SCAR标记在退化菌株中的特异性，推测获得的SCAR标记可能与草菇菌丝生长退化性状连锁。

图6 引物标记SCAR250在草菇8个菌丝退化菌株和4个对照菌株中的扩增结果1.Marker 1；2～9.菌丝退化菌株VNM；10～13.对照菌株(V51)Fig.6 Amplification of primer SCAR250 for 8 degenerative strains and 4 CKs of Volvariella volvacea1.Marker 1；2-9.Degenerative strains VNM；10-13.CK (V51)

3 讨论与结论

在草菇的生产实践中，菌种退化是制约其产业化开发的一大瓶颈。食用菌菌种退化的本质是遗传变异[3]。草菇菌丝属初级同宗结合真菌，单孢可孕，菌丝细胞多核。群体分离分析法(Bulked segregation analysis，BSA)是1991年由Michelmore等[31]提出的。本研究在构建基因组DNA混合池时，选择的草菇菌株(对照菌株V51和菌丝退化菌株VNM1～10)不但目的性状表现明显，且其他性状基本一致，这样既有利于筛选到与菌丝退化草菇性状相关的DNA差异，又可以节省时间，减少工作量。

本研究在对草菇菌丝退化菌株与对照菌株基因池进行的PCR扩增中发现，标记SCAR250仅在菌丝退化菌株基因池中有扩增片段，对照菌株基因池中无扩增片段，表明SCAR250标记可能是菌丝退化草菇菌株的特异标记；随后进行了草菇8个菌丝退化单株与4个对照单株的验证，结果所有草菇菌丝退化单株都存在SCAR250标记，而4个对照单株均无此标记，此扩增结果进一步证实了上述观点。片段VNMDF是通过SRAP引物对Me8-Em4扩增而获得的，特异性很差，检测不便，因此在此基础上开发了SCAR标记SCAR250。SCAR标记十分稳定．在应用上具有迅速、简便、低成本的特点[18]。SCAR250标记只需对简单提取的草菇总DNA进行PCR操作，即可在几小时内鉴定草菇菌株的类型。

进一步对得到的标记片段VNMDF进行序列分析发现，该标记与26S蛋白酶体亚基的核酸序列和氨基酸序列相似性较高，分别为81%和93%。泛素/26S蛋白酶体系统(Ubiquitin-26S proteasome system，UPS)是细胞内重要的蛋白质降解系统[32]。它主要由泛素激活酶、泛素结合酶、泛素蛋白连接酶和26S蛋白酶体组成[33]。它通过调节功能蛋白质的周转(Turn over)或降解不正常蛋白，实现对多种代谢过程的调节。因此，推测草菇菌丝生长退化菌株可能是由于编码26S蛋白酶体亚基的DNA序列发生突变引起的。

本试验通过SRAP技术，对草菇正常菌株V51与其菌丝退化菌株VNM的基因组DNA进行分析，结果筛选到1条存在于菌丝退化菌株中，且与草菇菌丝退化可能有重大关联的SRAP标记，并成功将其转化成SCAR标记，该标记序列与26S蛋白酶体亚基的核酸序列和氨基酸序列有着很高的相似性，但对于该标记影响草菇菌丝退化的具体机制，仍需进一步研究。

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Screening of molecular markers associated with degeneration ofVolvariellavolvaceastrains

LI Dan-qing,WANG Jie

(CollegeofFoodScience,SouthChinaAgricultureUniversity,Guangzhou,Guangdong510640,China)

【Objective】 The aim of this paper was to screen molecular markers closely linked to hyphae degeneration ofVolvariellavolvaceausing sequence related amplified polymorphism (SRAP) technique and to lay foundation for further cloning and functional analysis of target genes.【Method】 NormalVolvariellavolvaceaV51 strains (CK) and 10 hyphae degenerate strains (VNM) were used to construct isogenic DNA pools by bulked segregation analysis (BAS) method.To find differential fragments between two types of strains,SRAP technique was used.After being recycled,differential fragments were ligated with PMD-18T vector.Then,recombinant plasmids pMD-VNMDF were transformed intoE.coliDH5α competent cells and positive clones were sequenced.Based on the identified fragment sequences,special primers were designed to convert target fragment into sequence-characterized amplification region (SCAR) marker.Amplification tests of normal growth strains V51 and mycelium degradation strains were performed to verify the authenticity and reliability of the marker.【Result】 From 81 pairs of SRAP primer combinations chosen to screen the markers linked to hyphae degeneration of straw mushroom,two could amplify stable different bands.With the primer pairs of Me8-Em4,a polymorphic fragment of 300 bp (named VNMDF) was found in the degenerate strains gene pool.By recycling,sequencing and sequence analysis,it was found that the similarities of nucleic acid sequences and amino acid sequences between the fragment VNMDF and the fragment encoding the 26S proteasome subunits were 81% and 93%,respectively.A fragment of 250 bp was stably amplified by SCAR-specific primers SCAR250 in hyphae degenerate strains,and it was not detected in normal strains.【Conclusion】 In this study,a SRAP marker gene fragment closely linked to straw mushroom hyphae degeneration was obtained and successfully transformed into SCAR marker (SCAR250).

Volvariellavolvacea;strain degeneration;SRAP;SCAR

2014-09-19

高等学校博士学科点专项科研基金项目(20104404120011)

李丹青(1989-)，男，湖北随州人，在读硕士，主要从事食药用真菌生物技术研究。E-mail：492847382@qq.com

王 杰(1978-)，女，河南驻马店人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事食药用真菌生物工程研究。 E-mail：wjcasey@scau.edu.cn

时间:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.017

Q789；S646.1+3

A

1671-9387(2015)08-0195-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.017.html