花椒麻素在大鼠肠道的吸收动力学研究

刘秋妍，方国珊，刘 雄，林居纯

(1 四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130；2 西南大学 食品科学学院，重庆 400715)

花椒麻素在大鼠肠道的吸收动力学研究

刘秋妍1，方国珊2，刘 雄2，林居纯1

(1 四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130；2 西南大学 食品科学学院，重庆 400715)

【目的】 研究花椒麻素在大鼠肠道的吸收动力学特征。【方法】 以SD大鼠为供试动物，建立大鼠体循环肠灌流模型，并采用建立的高效液相色谱法(HPLC)测定肠循环液中花椒麻素质量浓度，研究花椒麻素在大鼠肠道不同部位(十二指肠、空肠、回肠、结肠)的吸收特性，分析不同质量浓度花椒麻素对大鼠肠吸收速率常数(Ka)、吸收百分率(P)和吸收半衰期(t1/2)的影响。【结果】 25～100 μg/mL花椒麻素在大鼠肠道的Ka为30.0～65.0 min-1，P为30.16%～56.81%，t1/2为100.10～232.09 min。花椒麻素在各肠段的P和Ka均随其质量浓度的增加而增大，而t1/2随其质量浓度的增加而减少。花椒麻素Ka和P均按空肠、回肠、十二指肠、结肠顺序依次下降，而t1/2依次升高。【结论】 花椒麻素在大鼠肠道的吸收过程属于一级动力学过程，属被动转运，吸收部位主要是空肠和回肠。

花椒麻素；SD大鼠；在体肠灌流；高效液相色谱法；肠吸收动力学

花椒麻素是花椒中重要的活性物质，属链状不饱和脂肪酸酰胺类，具有杀虫、抗炎、镇痛、抗菌、除皱等功效，可应用于医药和化妆品行业[1-4]。在新药研制过程中，研究药物的体内代谢动力学规律，可以提高药物研制成功率，节约成本，为临床合理用药提供科学依据[5]。因此，研究花椒麻素的药物代谢动力学对其开发利用具有重要意义，但目前有关花椒麻素的药动学研究却鲜有报道。日本学者Iwabu等[6]研究了大建中汤中羟基-α-山椒素浓度在人血液和尿液中的变化规律，结果显示，4名健康志愿者口服15 g大建中汤后血液和尿液中均能检测到羟基-α-山椒素，其中血液中药物浓度在给药后0.5 h达到峰值，随后浓度下降；Munekage等[7]比较了大建中汤中羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素在不同人群的代谢差异，结果表明，羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素在体内的代谢与体质指数、体质量和年龄有关，而与种族无关。为了解花椒麻素口服吸收动力学规律，本研究建立大鼠体循环肠灌流模型，采用HPLC法检测花椒麻素的质量浓度，研究其在大鼠肠道的吸收动力学特征，以期为其制剂生产和临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 药品与试剂 花椒麻素，按文献[8]的方法提取，纯度(质量分数)>97%；五味子醇甲，纯度(质量分数)>98%，为南通飞宇生物科技有限公司产品；甲醇，分析纯，为美国Spectrum公司产品；酚红、氯化钠、氯化钾、氯化镁、葡萄糖等均为成都科龙化学试剂有限公司产品。

1.1.2 主要仪器 LC-20A高效液相色谱仪、Interstil ODS-SP C18柱，日本岛津公司；HL-2恒流泵，上海青浦沪西仪器厂。

1.1.3 试验动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量(240±20) g/只，购于重庆腾鑫比尔实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(渝)2007-0008。

1.2 肠循环液中花椒麻素高效液相色谱法(HPLC)的建立

1.2.1 溶液的配制 肠循环液的配制：按文献[9]的方法配制肠循环液(Kreb-Ringer’s营养液，简称K氏液)。

酚红标准液的配制：精密称取酚红0.5 mg，用100 μL K氏液溶解，再用K氏液配制质量浓度分别为0，20，30，40和50 μg/mL酚红标准液。

花椒麻素贮备液的配制：精密称取花椒麻素 1.0 mg，用100 μL甲醇溶解，加5 mL质量浓度20 μg/mL酚红标准液超声15 min，制成花椒麻素贮备液。

花椒麻素标准液的配制：精密吸取花椒麻素贮备液适量，用质量浓度20 μg/mL的酚红标准液稀释为0，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 μg/mL花椒麻素标准液。

供试液的配制：精密称取花椒麻素1.0 mg，用100 μL甲醇溶解，再用质量浓度20 μg/mL酚红标准液配成25，50和100 μg/mL的含药循环液，超声15 min，分别作为花椒麻素供试液1、供试液2和供试液3。

1.2.2 色谱条件 Interstil ODS-SP C18柱(250 mm×4.6 mm，粒径5 μm)；流动相：甲醇-蒸馏水混合液(V(甲醇)∶V(蒸馏水)=7∶3)；流速：0.5 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：254 nm；进样量：20 μL。

1.2.3 酚红及花椒麻素标准曲线的绘制 酚红标准曲线：精密移取用K氏液配制的系列酚红标准溶液各0.5 mL，分别加0.2 moL/L NaOH溶液5 mL配成待测液。以0.2 moL/L NaOH溶液为空白，在558 nm处测定吸光度(A558)，以A558为因变量(y)，酚红质量浓度为自变量(x)绘制曲线，进行线性回归分析。

花椒麻素标准曲线：精密移取用K氏液配制的花椒麻素系列标准溶液各1 mL，分别加入60 μg/mL内标液五味子醇甲40 μL,用甲醇定容至5 mL，过0.22 μm有机滤膜，用HPLC测定花椒麻素的质量浓度。以花椒麻素标准液的质量浓度为横坐标(x)，以花椒麻素的HPLC峰面积与内标五味子醇甲HPLC峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，进行线性回归分析。

1.2.4 HPLC法专属性的考察 分别取K氏液、5 μg/mL花椒麻素标准液及25 μg/mL花椒麻素供试液1 mL，加入60 μg/mL内标五味子醇甲40 μL，K氏液和25 μg/mL花椒麻素供试液在大鼠肠循环2 h后，进行HPLC分析；5 μg/mL花椒麻素标准液直接进行HPLC分析。

1.2.5 HPLC法的回收率及精密度 用K氏液液配制1，10，100 μg/mL花椒麻素溶液，分别加入60 μg/mL内标五味子醇甲40 μL，进行HPLC分析，根据花椒麻素标准曲线计算回收率。每个样本测定5次，连续检测3 d ，计算日内和日间精密度。

1.3 花椒麻素在肠循环液中的稳定性

取K氏液配制的1，10和100 μg/mL花椒麻素溶液，置于37 ℃水浴锅中，分别于0，30，60，90和120 min取样，进行HPLC分析。

1.4 花椒麻素在大鼠肠组织不同部位的吸收试验

参照文献[10-12]方法进行。取12只SD大鼠随机分成3组，麻醉后沿腹中线打开腹腔，结扎胆总管，在所需肠段(十二指肠、空肠、回肠、结肠)两端剪切后插管，结扎；取100 mL预热至37 ℃的花椒麻素供试液，以5 mL/min流速平衡15 min后，将流速调为2.5 mL/min，分别于0，15，30，45，60，75，90，105和120 min取样2 mL，经0.22 μm有机滤膜过滤，同时补充等量的酚红循环液。用HPLC法和UV法分别测定花椒麻素和酚红的质量浓度。按文献[12-13]的方法计算花椒麻素的吸收速率常数(Ka)、吸收百分率(P)和吸收半衰期(t1/2)。

2 结果与分析

2.1 酚红和花椒麻素标准曲线的绘制

在质量浓度为0～50 μg/mL时，酚红质量浓度(x)与A558(y)线性关系良好，标准曲线为y=0.137 6x+0.209 9(r=0.996 7)(图1)。在0～100 μg/mL 范围内，花椒麻素质量浓度(x)和花椒麻素的HPLC峰面积与内标五味子醇甲峰面积的比值(y)的线性关系良好，标准曲线为y=1.103 1x-0.856 4(r=0.999 7)(图2)。

图1 肠循环液中酚红的标准曲线Fig.1 Standard curve of phenolsulfonphthalein in Kreb-Ringer’s solution

2.2 HPLC法的专属性

图3-A、B、C分别为K氏液、花椒麻素标准液和花椒麻素供试液的色谱图。在图3-A、3-B、3-C中均出现内标五味子醇甲峰，其保留时间均约为17.2 min。由图3-B可见，花椒麻素的保留时间约为22.4,23.5和24.7 min，花椒麻素主峰分离明显，K氏液中杂质未干扰花椒麻素和内标五味子醇甲的测定。

2.3 HPLC法的回收率与精密度

试验结果显示，1，10，100 μg/mL花椒麻素溶液的回收率分别为(101.73±2.92)%，(100.66±2.79)%和(98.96±1.60)%(n=5)；日内精密度分别为2.53%，2.22%和1.96%；日间精密度分别为5.43%，3.22%和3.17%。表明HPLC法回收率高，重现性好，符合生物样品测定要求。

2.4 花椒麻素在肠循环液中的稳定性

由表1可知，肠循环液中质量浓度为1，10和100 μg/mL花椒麻素在37 ℃水浴120 min，溶液中花椒麻素的质量浓度并无明显变化，表明花椒麻素在肠循环液中是稳定的，设定的试验条件不影响花椒麻素的测定。

2.5 花椒麻素在大鼠肠组织不同部位的吸收动力学特点

将25，50及100 μg/mL花椒麻素供试液在大鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠循环回流2 h，其吸收速率常数(Ka)、吸收半衰期(t1/2)及吸收百分率(P)见表2。由表2可见，花椒麻素在各肠段的P和Ka均随其质量浓度的增加而增大，而t1/2随其质量浓度增加而减少。不同质量浓度花椒麻素在大鼠肠道的吸收无浓度饱和现象，符合Ficks扩散原理，属被动转运。

由表2还可见，不同质量浓度花椒麻素吸收速率常数(Ka)按空肠、回肠、十二指肠、结肠顺序依次下降，其中结肠与十二指肠、空肠与回肠吸收速率常数无显著差异(P>0.05)，而结肠、十二指肠吸收速率常数显著低于空肠、回肠 (P<0.05)。此外，空肠、回肠吸收速率常数均较高，说明空肠、回肠为花椒麻素的主要吸收部位。花椒麻素的吸收半衰期按空肠、回肠、十二指肠、结肠顺序依次升高，其中十二指肠的吸收半衰期显著高于空肠、回肠。吸收百分率按空肠、回肠、十二指肠、结肠顺序依次下降，不同肠段之间存在显著或极显著性差异。

图3 花椒麻素在大鼠肠循环液中的色谱图A.在肠循环2 h的K氏液；B.5 μg/mL花椒麻素标准液；C.在肠循环2 h的25 μg/mL花椒麻素供试液Fig.3 HPLC chromatograms of alkylamide from Zanthoxylum in Kreb-Ringer’s solution in vivoA.Kreb-Ringer’s solution circulating in intestinal for 2 h;B.Standard solution of alkylamide (5 μg/mL) in Kreb-Ringer’s solution; C.Alkylamide sample (25 μg/mL) circulating in intestinal for 2 h

表1 花椒麻素在肠循环液中水浴0～120 min时的稳定性Table 1 Stability of alkylamide from Zanthoxylum in Kreb-Ringer’s solution in 0-120 min

表2 花椒麻素在大鼠肠道循环2 h后各肠段的吸收参数(n=4)Table 2 Intestinal absorption parameters of alkylamide from Zanthoxylum circulating for 2 h in rats’ intestine (n=4)

续表2 Continued table 2

注：同列数据后标不同小写字母表示与十二指肠相比差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示与十二指肠相比差异极显著(P<0.01)。

Note:Compared with duodenum,difference small letters indicate significant difference at same concentration (P<0.05),while different capital letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

考察大鼠不同肠段的吸收情况可见，各肠段剩余花椒麻素质量浓度的常用对数值(lnX)与取样时间(t)线性回归线性回归方程的相关系数r值均大于0.9，说明在大鼠不同肠段内，花椒麻素质量浓度下降与循环时间呈线性关系。不同质量浓度花椒麻素在不同肠段的吸收结果说明，花椒麻素在大鼠肠道内的吸收动力学为一级吸收。

3 讨论与结论

口服是中药及其制剂最常见的临床给药途径之一，肠道作为口服制剂的主要吸收部位，肠内上皮细胞的屏障作用和肠道酶菌系统是吸收的主要屏障，药物在肠道的吸收程度和速率影响着药物的疗效。具有较好的吸收性及合适的生物利用度是先导化合物成为药物的必要条件之一[14-16]。

有研究显示，药物在大鼠体内的吸收与其在人体内的吸收具有非常高的相关性，可以用大鼠代替人体进行药物口服吸收方面的研究。目前大鼠体循环肠灌流模型已在国内外广泛应用于药物肠吸收的研究[17-18]。但该法也存在局限性，在试验过程中需考察药物在空白肠循环液中的稳定性。此外，肠道在吸收药物的同时也会吸收水分，从而导致供试液体积减少，故不能通过直接测定药物浓度来计算剩余药量。因此，常采用加入不被肠道吸收的酚红校正循环液体积的方法，测定肠道对水分的吸收[14,19]，故本试验采用酚红法来确定循环过程中的药液体积。

药物的转运机制主要分为被动转运和主动转运，大部分药物的吸收属被动转运，符合Ficks扩散原理[20]。在吸收面积不变时，药物吸收量与浓度成正比，吸收系数为常数。本研究中，当花椒麻素质量浓度为25～100 μg/mL时，在大鼠肠循环2 h后，吸收百分率和吸收速率常数均随着供试液中花椒麻素质量浓度的增加而增大，药物吸收无浓度饱和现象，符合Ficks方程，表明花椒麻素在大鼠肠道的吸收为被动转运。此外，循环液中花椒麻素剩余质量浓度常用对数值与时间间的线性回归方程的相关系数r大于0.9，表明花椒麻素质量浓度的下降与循环时间呈线性关系，为一级吸收动力学。

比较花椒麻素在大鼠不同肠段吸收速率常数和吸收百分率可见，吸收速率常数和吸收百分率均按空肠、回肠、十二指肠、结肠顺序依次下降，空肠和回肠是花椒麻素吸收的主要部位。

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Invivoabsorptive dynamics ofZanthoxylumalkylamide in rat intestines

LIU Qiu-yan1,FANG Guo-shan2,LIU Xiong2,LIN Ju-chun1

(1CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China;2CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)

【Objective】 This study aimed to investigateinvivoabsorptive characteristics of Alkylamide fromZanthoxylumin rate intestines.【Method】Invivointestinal perfusion model in Sprague Dawley rat was established to study the intestinal absorption kinetics ofZanthoxylumAlkylamide.The concentrations ofZanthoxylumAlkylamide in intestinal circulating fluid were determined by HPLC.The absorptive characteristics in duodenum,jejunum,ileum and colon,and the effects of different concentrations on absorption rate constants (Ka),absorption percentage (P) and absorption half-life period (t1/2) ofZanthoxylumAlkylamide were also evaluated.【Result】 When the alkylamide concentration ranged from 25 to 100 μg/mL,Ka,P,andt1/2were 30.0 to 65.0 min-1,30.16% to 56.81%,and 100.10 to 232.09 min,respectively.KaandPdecreased whilet1/2increased with the increase of alkylamide concentration.KaandPdecreased,whilet1/2increased in the order of jejunum,ileum,duodenum,and colon.【Conclusion】 The rat intestinal absorption of alkylamide fromZanthoxylumwas confirmed to follow passive transport way. Jejunum and ileum were the major absorption sites.

Alkylamide fromZanthoxylum;SD rate;invivointestinal perfusion model;HPLC;absorptive dynamics

2015-01-02

国家自然科学基金项目“花椒麻素对细胞阳离子流的影响及其调节体内脂质代谢的机理研究”(NSFC31171679)

刘秋妍(1993-)，女，重庆江津人，在读本科生，主要从事药学研究。E-mail:1024124722@qq.com

林居纯(1968-)，女，四川隆昌人，教授，硕士生导师，主要从事兽医药理与毒理学研究。E-mail:juchunlin@126.com

时间:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.029

S865.1+2

A

1671-9387(2015)08-0057-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.029.html