微小RNA-143诱导胃癌细胞株BGC-S23凋亡机制的探讨

霍中华，张晓燕，邱 彦，刘菲菲

·临床医学··论著·

微小RNA-143诱导胃癌细胞株BGC-S23凋亡机制的探讨

霍中华，张晓燕，邱 彦，刘菲菲

目的 探讨微小RNA-143(miRNA-143)诱导胃癌细胞BGC-823产生凋亡的机制。方法 生物信息学预测B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,bcl-2)3'非编码区(untranslation region,UTR)是否存在miRNA-143的结合位点；荧光定量及免疫印迹方法检测胃癌细胞株(BGC-823)及正常胃黏膜细胞株(GES-1)中Bcl-2 mRNA及其蛋白含量；荧光素酶报告基因法验证结合位点；化学法合成miRNA-143-mimics、inhibitor及NC序列并转染BGC-823细胞,转染后48 h收集细胞、蛋白质印迹法检测细胞内Bcl-2蛋白含量；实时定量PCR检测转染后不同时间点BGC-823细胞内miRNA-143含量变化,同时流式法检测BGC-823细胞凋亡。结果 与GES-1细胞比较,BGC-823细胞中Bcl-2蛋白含量及miRNA-143含量差异有统计学意义(P＜0.01)；miRNA-143-mimics、miRNA-143-inhibitor与野生型荧光素酶报告基因共转染组可以明显抑制或者增强荧光素酶活性,转染后48 h,组间酶活性差异有统计学意义(P＜0.05),miRNA-143-mimics和miRNA-143-inhibitor转染对突变型荧光素酶报告基因活性无明显影响,差异无统计学意义(P＞0.05)；BGC-823细胞转染miRNA-143-mimics和miRNA-143-inhibitor能够明显抑制或者促进细胞内Bcl-2蛋白表达,差异有统计学意义(P＜0.05)；miRNA-143-mimics和miRNA-143-inhibitor转染细胞能够明显引起细胞内miRNA-143含量的改变,转染后48 h,miRNA-143-mimics转染组细胞内miRNA-143含量明显上升,miRNA-143-inhibitor转染组细胞内miRNA-143含量明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05),阴性对照转染对照组和转染对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；细胞凋亡检测结果表明,miRNA-143表达量的升高能够明显引起BGC-823细胞的凋亡,基因干预组与转染对照组相比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论 miRNA-143通过抑制Bcl-2基因表达,可引起胃癌细胞株BGC-823细胞产生凋亡。

B淋巴细胞瘤-2；胃癌细胞株；微小RNA-143；凋亡

据统计,近5年来,我国每年新发胃癌40万例,发病率占全世界的42%左右,我国胃癌患者约占全球胃癌患者总数的40%［1］。预计到2015年,我国胃癌的发病率还将以每年1.6%的幅度攀升,数据惊人,研究胃癌发病机制,寻找新的有效治疗途径,刻不容缓。

在Bcl-2蛋白家族中,目前已发现25种Bcl-2同源蛋白,其成员与细胞凋亡具有密切的关系。人Bcl-2基因于1984年被发现,Bcl-2基因在众多调节细胞程序性凋亡家族基因中被发现［2］。细胞增殖异常性疾病,同时也是细胞凋亡异常性疾病,细胞凋亡失控是导致肿瘤发生发展的重要方面,有研究表明, Bcl-2做为凋亡的抑制物,其与胃癌的关系密切［3-4］。胃癌的形成与Bcl-2的高表达有关,而且主要作用阶段在癌变的早期,提示Bcl-2蛋白可能在胃癌的发病和治疗反应性方面起重要作用［5］。由于Bcl-2基因异常表达导致肿瘤恶性程度不断升高,Bcl-2基因不同程度地参与了胃癌的凋亡调控［3］,故Bcl-2基因与胃癌的演进有关,在肿瘤的化疗中Bcl-2基因可通过抑制肿瘤细胞的凋亡而影响有效的治疗。本研究对胃癌细胞株BGC-823细胞及正常胃黏膜细胞GES-1细胞中Bcl-2的基因蛋白表达进行检测和差异分析,通过生物信息预测可能对Bcl-2基因表达进行调控的miRNAs,通过荧光素酶报告基因系统对预测靶位关系进行验证,最终在BGC-823细胞中干预miRNA表达,通过调整Bcl-2蛋白表达来诱导肿瘤细胞凋亡的可行性,为胃癌的临床治疗提供新的基因靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

实验用细胞株均购于中国科学院上海细胞所。胎牛血清,RPMI-1640细胞培养基、胰蛋白酶为Hyclone公司产品,转染试剂、Trizol,cDNA制备试剂盒均购于美国Invitrogen公司,荧光素酶报告基因表达载体和荧光素酶活性检测均为Promega公司产品,蛋白一抗及二抗为美国CST公司产品,细胞总蛋白提取、定定量试剂盒、化学发光试剂盒均为美国Pierce公司产品,miRNA合成、测序均在上海生工进行,细胞凋亡检测试剂盒为BD公司产品。

1.2 仪器和设备

细胞培养箱为日本三洋公司产品,离心机为Beckman公司产品,微量移液器为Gilson公司产品,电泳仪,垂直电泳槽及湿法转膜仪均为Bio-rad公司产品,酶标仪Thermo公司产品,PCR仪购于ABI公司,流式细胞仪为BD公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 以Bcl-2为靶基因的miRNAs预测 采用targetscan预测软件对Bcl-2(NM_000633)3'UTR区是否存在miRNA的结合位点。分析结果显示,miRNA-143在Bcl-2基因3'UTR区存在结合位点,预测结果显示(图1),hsa-miRNA-143在Bcl-2基因的3' UTR区存在7个碱基的种子区。

图1 hsa-m iRNA-143与Bcl-2的靶位关系预测

1.3.2 胃癌细胞株BGC-823及正常胃黏膜上皮细胞GES-1中Bcl-2蛋白含量及miRNA-143相对含量分析 取对数生长期的BGC-823细胞及GES-1细胞各5×106个,离心5 min收集细胞沉淀,分别提取细胞总蛋白和细胞总RNA,Western blotting检测Bcl-2蛋白含量,RT-PCR检测细胞内miRNA-143含量。(1)蛋白质印迹分析Bcl-2蛋白相对含量:向细胞沉淀中加入1 ml无菌磷酸盐缓冲液(dPBS)洗细胞两遍,去掉dPBS,每孔加入0.5 ml细胞裂解液,按照试剂盒说明书提取细胞总蛋白,BCA法定量细胞总蛋白浓度。定量后的细胞总蛋白,每组10μl进行垂直电泳,SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶浓度为10%,经110 V电压90 min电泳后,立春红染色观察蛋白条件是否完整,400 mA电流转膜90 min,转膜后5%的脱脂牛奶封闭2 h,4℃一抗过夜孵育,Bcl-2和GAPDH一抗稀释(TBST)比分别为1∶300和1∶1 000；TBST洗膜3次,加入二抗孵育2 h,羊抗鼠二抗稀释比为1∶4 000；TBST洗膜3次,添加化学发光液反应底物,暗室曝光,扫描曝光底片,统计目的条带光密度值。目的蛋白光密度值/GAPDH光密度值,即为检测蛋白相对含量。(2)成熟体miRNA-143含量检测:对于每组细胞沉淀,使用4℃预冷dPBS洗去细胞表面残留的培养液及血清；去掉PBS,每孔加入1 ml。4℃预冷的Trizol细胞裂解液,震荡培养板充分裂解细胞,4℃5 min,将分层后的溶液上清转移到无菌1.5 m l离心管,酚氯仿法抽提RNA,得到沉淀后用20μl DEPC水溶解,琼脂糖凝胶电泳观察RNA纯度及完整性,紫外分光光度测定RNA浓度。取2μl的总RNA,逆转录制备cDNA,特异反转录引物,H.sapiens 6 snRNA:5'-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3',miRNA-143:5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAAGAGCT-3',取2μl反转录产物作为PCR反应模板,荧光定量法检测miRNA-143含量检测。2ΔΔCt法分析定量结果,内参选用U6(NM_001101. 3)。PCR反应引物序列为:U6-上游引物,5'-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3',U6-下游引物5'-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3'；miRNA-143-上游引物5'-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3',miRNA-143-下游引物5'-TGAGATGAAGCACTGTAGCTC-3'。PCR反应使用20μl体系,其中,SYBR Premix Ex Tap 10μl,引物(20μM)各取0.2μl,模板使用量为2μl,反应体系用无菌H2O补足。PCR反应条件: 95℃变性10 s；58℃退火10 s；72℃延伸10 s,循环数设置为40。

1.3.3 hsa-miRNA-143与Bcl-2预测靶位关系的验证 取对数生长期293细胞,Trizol裂解法提取细胞总RNA,反转录制备cDNA。设计针对Bcl-2基因3' UTR区设计PCR引物:上游引物为,5'-GCTCTAGA TTATATACCATTTATCTG-3',下游引物为,5'-GCTCTAGA TTTGCTCACAAATAGTGTATAGG-3',引物两端分别添加XbaI酶切位点,PCR扩增包含miRNA-143靶位“5'-CAUCUCA-3'”在内的162 bp长的碱基序列。取2μl cDNA为模板,使用上面引物进行PCR扩增,94℃变性30s,55℃退30 s,72℃延伸10s,循环数为38个。扩增后使用XbaI对PCR产物进行酶切处理,酶切回收目的片段后克隆到PGL3-promoter荧光素酶报告基因表达载体,重组载体经序列分析后命名为pGL3-Pro-WT-Bcl-2。以pGL3-Pro-WT-Bcl-2为基础,对miRNA-143靶位进行点突变,即将“5'-CATCTCA-3'”突变为“5'-ACCTATC-3'”,构建突变型荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Pro-MT-Bcl-2。对2组荧光素酶报告基因表达载体进行无内毒素质粒DNA提取。同时,化学法合成RNA:miRNA-143-mimics,miRNA-143-inhibitor, miRNA-143-NC。

选取生长状况良好且处于对数生长期的第三代293细胞,用胰酶消化并制备细胞悬液,台酚蓝染色后使用血小球计数板进行活细胞计数,使用完全培养基(DMEM+10%胎牛血清)调整细胞密度为1× 105个/m l,将细胞接种到6孔板,每孔加2 m l细胞悬液,37℃和5%CO2条件下培养24 h,参照Lipofectmaine 2000转染试剂说明书进行质粒和RNA共转染,同时每组细胞转染100 ng的pGL-TK(海肾荧光素酶报告基因)作为荧光霉素活性的检测参照。转染后48 h,使用Promega公司的双荧光素酶检测系统和荧光素酶检测仪进行荧光素酶含量检测。

1.3.4 转染miRNA-143对胃癌细胞株BGC-823胞内Bcl-2蛋白表达影响检测 细胞转染取对数生长期的BGC-823细胞,胰酶消化后收集细胞,使用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞,调整细胞浓度至1×105个/ml,接种细胞到6孔细胞培养板,每孔添加2 ml细胞悬液,37℃和5%CO2条件下培养24 h,后进行转染实验,转染过程按照Lipofectmaine 2000说明书进行。收集转染后48 h的细胞,提取细胞总蛋白,Western blotting检测细胞内Bcl-2蛋白相对含量。

1.3.5 转染后细胞凋亡及细胞内miRNA-143含量检测 实验分为未转染组、转染对照组(NC)和miRNA-143-mimics单构转染组,取转染后48 h的BGC-823细胞,使用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞,收集细胞沉淀,使用dPBS洗细胞2遍,收集细胞沉淀,按Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书加入PI及FITC,避光室温孵育20 min后,上机检测。激发波长Ex=488 nm,Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测,红色荧光通过PI通道(FL2)检测。同时,收集细胞,提取细胞总RNA, RealTime-PCR检测细胞内miRNA-143相对含量。

1.4 统计学处理

所有操作均以SPSS 13.0统计软件完成,实验所得数据计量资料采用均数±标准差(±s)表示,采用单因素方差分析,其中多组资料两两比较采用LSD多重检验,检验水准a=0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌细胞BGC-823及胃黏膜上皮细胞GES-1细胞中Bcl-2蛋白及miRNA134含量检测

2组细胞中Bcl-2蛋白含量检测结果(图1A)显示,BGC-823细胞中Bcl-2蛋白相对含量(2.17± 0.28)明显高于GES-1细胞(1.00±0.81),差异有统计学意义(P＜0.01),这说明Bcl-2在胃癌细胞中呈高表达。miRNA-134相对含量检测数据(图1B)说明,BGC-823细胞中miRNA-143相对含量(0.21± 0.01)明显低于GES-1细胞(1.00±0.10),差异有统计学意义(P＜0.01)。2组结果说明,在胃癌细胞中Bcl-2蛋白表达与miRNA143含量显著负相关(相关系数为0.91)。

2.2 荧光素酶报告基因表达载体构建

PCR扩增得到特异的PCR产物,通过与DNA Marker比对,其大小与理论值(172 bp)完全相符(图2A)。成功构建野生型荧光素酶报告基因表达载体,并通过点突变成功构建野生型荧光素酶基因表达载体,测序分析与标准序列完全一致(图2B)。

2.3 hsa-miRNA-143与Bcl-2基因靶位关系验证

分别共转染miRNA-143-mimics、miRNA-143-inhibitor、miRNA-143-NC与2组荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Pro-WT-Bcl-2和pGL3-Pro-MT-Bcl-2,转染后48 h,对于野生型荧光素酶报告基因表达载体,miRNA-143-mimic能够明显抑制荧光素酶活性,从36.80±6.18降至7.20±1.23,差异有统计学意义(P＜0.01),而miRNA-143-inhibitor转染组荧光素酶相对活性则从36.80±6.18上升到55.40± 9.12,与单独野生型荧光素酶转染组(37.8±4.2)比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；对于突变性荧光素酶报告基因表达载体,miRNA-143-mimic共转染(40.2±4.5)与pGL3-Pro-MT-Bcl-2单独转染组(39.8±4.1)比较,差异无统计学意义(P＞0.05), miRNA-143-inhibitor转染(39.2±4.9)对突变型荧光素酶报告基因活性(49.8±4.1)也无明显影响(P＞0.05)；miRNA-143-NC与pGL3-Pro-WT共转染组(36.60±7.22)对野生型荧光素酶报告基因表达载体转染组荧光素酶活性(36.80±6.18)明显影响,差异无统计学意义(P＞0.05),miRNA-143-NC与pGL3-Pro-MT共转染组(49.7±4.4)对突变型荧光素酶报告基因表达载体转染组荧光素酶活性(49.8± 4.1)明显影响,差异无统计学意义(P＞0.05)。以上数据和结果说明,miRNA-143与Bcl-2基因之间的预测靶位确实存在。

图1 胃癌细胞BGC-S23及胃黏膜上皮细胞GES-1细胞中Bcl-2蛋白及m iRNA134含量检测

图2 克隆构建及序列分析

2.4 转染后BGC-823细胞内Bcl-2蛋白含量检测

Western blotting检测转染miRNA-143后BGC-823细胞中Bcl-2蛋白相对含量。细胞转染48 h后,转染组细胞内Bcl-2蛋白含量较转染对照组及对照转染组均有明显变化,其中转染对照组Bcl-2蛋白含量为1.00±0.25,mimics转染组细胞内Bcl-2蛋白含量为0.19±0.02,组间差异有统计学意义(P＜0.01),inhibitor转染组的细胞内Bcl-2蛋白则上升至1.36±0.36,与转染对照组(1.00±0.25)比较,差异有统计学意义(P＜0.05),转染对照组(1.00± 0.25)与未转染组(0.96±0.12)比较,差异无统计学意义(P＞0.05),说明转染试剂及转染过程对BGC-823细胞内Bcl-2蛋白表达无明显影响。见图3。

图3 转染后细胞内Bcl-2蛋白含量检测图

2.4 miRNA-143含量变化对BGC-823细胞凋亡的影响

细胞转染后48 h,收集细胞,双染法检测转染miRNA-143后细胞凋亡变化。流式检测结果显示,未转染组,NC转染组和miRNA-143-mimics转染组细胞的凋亡率分别为(16.22±2.11)%、(16.92± 1.83)%和(48.25±4.13)%,miRNA-143转染组与未转染组及阴性对照转染组比较,均有统计学差异(P＜0.05)。这说明,miRNA143表达升高,可以使肿瘤细胞BGC-823产生凋亡。见图4。

3 讨论

microRNAs(miRNAs,微小RNA)是一类分布广泛的内源性非编码蛋白质的RNA,核酸长度一般为20～25个碱基。miRNAs具有高度保守的遗传学特性,通过与基因3'UTR区的靶点结合,对基因进行转录后调控［6］。miRNAs与肿瘤的形成和发展具有密切关系,其在肿瘤发生发展中的作用更已成为国际生命医学研究的热点之一［7］。miRNA的表达与多种肿瘤进展及预后相关,可作为肿瘤标志分子。研究显示,固有的miRNA调控机制失常,是多种肿瘤中癌基因及抑癌基因异常表达的内在原因［8］。

图4 细胞增殖活性及m iRNA-143含量检测图

miRNA可以作为癌基因或抑癌基因发挥促癌或抑癌作用,miRNA与胃癌关系密切［9-10］。有研究人员使用miRNA芯片技术对胃癌及癌旁组织进行表达谱分析,结果发现miRNA-21、miRNA-191、miRNA-223、miRNA-24、miRNA-107、miRNA-92和miRNA-221等在胃癌中呈高表达［11］,也有研究发现,相比于正常组织,胃癌组织中miRNA-128b、miRNA-129和miRNA-148的表达显著降低［12］。胃癌是一种多基因疾病,其发生发展是一个多步骤参与、多种相关基因失活的结果,而miRNA在胃癌的发生发展中具有致癌或者作抑癌的双重作用,microRNA在胃癌中表达失调的情况被相继报道,Zhang等［13］研究发现miRNA-650在胃癌中表达上调,miRNA-21在人胃癌组织及细胞株中显著性过表达［14］,而miRNA-218被证实有潜力作为抑制胃癌转移的靶向治疗候选基因之一,miRNA-101在胃癌组织和胃癌细胞中显著低表达。并且miRNA-101过表达可以明显抑制细胞的增殖、侵袭和迁移［15］。尽管胃癌与miRNA关系的研究已取得一定的进展,寻找miRNA的靶蛋白或靶基因,研究调控miRNA表达的分子机制从而指导基因治疗仍是该领域重要的研究方向。miRNAs是否通过Bcl-2对胃癌细胞凋亡产生调控作用,是一个值得研究的课题。

实验中,笔者尝试并寻找miRNA-143通过其靶基因Bcl-2基因对胃癌细胞凋亡具有调控作用的,并最终应运miRNA理论来解释miRNA-143-Bcl-2与BGC-823细胞之间的关系。研究中,首先利用miRNA靶位的生物学预测在线软件TargetScan进行分析,发现在Bcl-2的3'UTR有两处位置存在miRNA-145的结合位点,对于预测的结合位点,则进一步通过荧光素酶报告基因进行了验证,miRNA-143可以用过其位于保守区的结合位点,结合于3'UTR,并对其上有的基因翻译产生抑制作用。而非保守区位点为无效位点,之所以出现这样的原因,可能与位点所处位置有关,另外,从miRNA进化的角度考虑,其对于靶基因结合区域的物种间保守性也是要求较高的。

研究结果表明,胃癌细胞株BGC-823细胞中的Bcl-2蛋白表达明显高于正常胃黏膜细胞株,而miRNA-143含量在两组细胞中的趋势与Bcl-2蛋白含量负相关；通过脂质体转染法在BGC-823细胞内可以有效干预miRNA-143的表达,在BGC-823细胞中,过表达miRNA-143可以通过抑制Bcl-2蛋白的表达诱导肿瘤细胞产生凋亡增加的趋势。这些实验结果和数据提示,miRNA-143的低表达可能是BGC-823细胞中Bcl-2基因异常的关键原因,通过基因干预的方法在BGC-823细胞中过表达miRNA-143,可以通过抑制其靶基因Bcl-2基因的表达,有效诱导肿瘤细胞凋亡的过程在实验中均得到证实。本研究的意义在于证实miRNA-143的低表达是BGC-823细胞中Bcl-2蛋白高表达的主要原因,在细胞内过表达miRNA-143可以增加肿瘤细胞凋亡,这为以新的基因为靶点的药物开发提供了新的思路。

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Study on themechanism involving the apoptosis of BGC-S23 strain induced by m iRNA-143

Huo Zhonghua,Zhang Xiaoyan,Qiu Yan,Liu Feifei

(No.454 Hospital of CPLA,Nanjing 210002,China)

Objective To investigate the mechanism involving the apoptosis of BGC-823 strain induced by miRNA-143. M ethods Fluorometry and Western blotwere used to detect Bcl-2 mRNA and the protein contents in the gastric cancer strain(BGC-823)and normal gastric mucosa strain(GES-1).We verified the binding site by a Lnciferase reportermethod.MiRNA-143-mimics,inhibitor and NCwere chemically synthesized.Bcl-2 protein levelsweremeasured byWestern blotting 48 hours after transiently transfected with eithermiRNA-143mimics,inhibitors,or negative controlmiRNAs into BGC-823 cells.Apoptosis assayswere employed to evaluate cell apoptosis in BGC-823 strain,and miRNA-143 expression levels in BGC-823 weremeasured by quantitative PCR(qPCR)simultaneously at different time points after transfection.Results The study successfully predicted and verified the putative miRNA-143 binding site in the 3'UTR of human Bcl-2 gene.Bcl-2 level in BGC-823 cellswas significantly increased andmiRNA-143 levelwas decreased,as compared with that of GES-1 cells,and significant differences could be noted,when comparisons were made between the groups(P＜0.01).Research results indicated thatmiRNA-143-mimics/miRNA-143-inhibitor and the wild type luciferase reporter geneco-transfection significantly reduced and induced the activity of luciferase.Forty-eight hours after transfection,statistical significance could be noticed,when the co-transfection group was compared with the single transfection group(P＜0.05).The transfection ofmiRNA-143-mimics and miRNA-143-inhibitors had no significanteffects on the activity ofmutant luciferase reporter gene.Statistical significance could be seen,when the co-transfection group was compared with the single transfection group(P＜0.05).Furthermore,the transfection ofmiRNA-143-mimics and miRNA-143-inhibitor could significantly inhibit or enhance the expression of Bcl-2 protein,and statistical significance could be found,when itwas compared with the control group(P＜0.05).miRNA-143-mimics and miRNA-143-inhibitor transfected cells could induce changes inmiRNA-143 level.Forty-eighthours after transfection,miRNA-143 level in themiRNA-143-mimics transfected cellswas obviously elevated,while that in themiRNA-143-inhibitor was significantly reduced,and statistical significance could also be noted,when itwas compared with the control group(P＜0.05).There were no significant differences in miRNA-143 levels,when the negative control group was compared with the transfected control group(P＜0.05).Results of apoptosis detection indicated that the elevated expression levelofmiRNA-143 could significantly induce apoptosis of BGC-823,and statistical significance could be seen,when the gene intervention group was compared with the transfected control group(P＜0.05).Conclusion Through the inhibition of Bcl-2 gene expression,miRNA-143 could induce the apoptosis of the gastric cancer BGC-823 strain.

Bcl-2；BGC-823；miRNA-143；Apoptosis

R34

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2015.06.012

2015-07-07)

(本文编辑:张阵阵)

210002 南京,解放军第四五四医院(霍中华、邱彦)；南京军区联勤部卫生部苜蓿园路干休所(张晓燕)；济南军区空军司令部门诊部(刘菲菲)