伏立诺他含量测定及其稳定性考察

詹长娟，徐伟，王翼，王华，卢玮

(南京理工大学泰州科技学院化工学院，泰州 225300)

伏立诺他含量测定及其稳定性考察

詹长娟，徐伟，王翼，王华，卢玮

(南京理工大学泰州科技学院化工学院，泰州 225300)

目的 建立测定伏立诺他含量及有关物质的高效液相色谱法，考察光照、温度和湿度对伏立诺他质量的影响。方法 采用Inertsil ODS-SP色谱柱，含量测定以0.1%磷酸溶液(三乙胺调节pH至3.0)-乙腈(70：30)为流动相，有关物质以0.1%磷酸溶液(三乙胺调节pH至3.0)-乙腈(60：40)为流动相；流速1.0 mL·min-1；检测波长242 nm；进样量20 μL；柱温30 ℃；样品超声时间20 min。依据2010年版《中华人民共和国药典》二部附录“原料药与药物制剂稳定性实验指导原则”的有关技术要求进行影响因素实验。结果 伏立诺他与各杂质之间均达到良好分离，伏立诺他在20.16～302.40 μg·mL-1范围内线性关系良好(r=0.999 7)。经影响因素实验后伏立诺他含量及有关物质均无明显变化。结论 伏立诺他对光照、高温、高湿稳定。

伏立诺他；含量；有关物质；色谱法，高效液相

伏立诺他是世界上第一个抑制组蛋白去乙酰基酶的新型抗癌药，于2006年在美国上市，临床用于其他药物无效、恶化或病情反复的转移性皮肤T淋巴细胞瘤[1]。除起始原料苯胺、辛二酸外，伏立诺他中还有可能有一些副产物如辛二酸单酰苯胺、7-苯胺基甲酰基庚酸甲酯[2-4]。笔者建立高效液相色谱法测定伏立诺他的含量及有关物质，并研究温度、湿度及光照对伏立诺他质量的影响。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LG-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)，SPD-20A紫外检测器，CTO-10AS柱温箱(日本岛津公司)，UV 2450紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)，AL 104分析天平(梅特勒-托利多，感量：0.1 mg)，WD-A药物稳定性检查仪。

1.2 试剂 伏立诺他对照品(含量99.5%，批号：20130326)、伏立诺他样品(批号：20130415，20130420，20130424)、辛二酸、辛二酸单酰苯胺(批号：20130415)、7-苯胺基甲酰基庚酸甲酯(批号：20130415)均由南京理工大学泰州科技学院制药工程专业实验室提供)，乙腈(色谱纯)，苯胺、三乙胺、磷酸、氯化钠、硝酸钾，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-SP(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(用三乙胺调节pH至3.0)(含量测定时为30：70，有关物质测定时为40：60)；检测波长242 nm；流速1.0 mL·min-1；进样量20 μL；柱温30 ℃。

2.2 对照品溶液及供试品溶液的制备 取伏立诺他对照品约50 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加入乙腈-水(30：70)超声20 min溶解，放冷，用乙腈-水(30：70)稀释至刻度，摇匀，得1 mg·mL-1储备液。精密量取储备液1 mL，置10 mL量瓶中，用乙腈-水(30：70)稀释至刻度，摇匀，即得100 μg·mL-1的对照品溶液。同法制备供试品溶液。

2.3 线性关系考察 分别精密量取对照品储备液0.2，0.5，1.0，2.0，3.0 mL，置10 mL量瓶中，用乙腈-水(30：70)稀释至刻度，摇匀，取20 μL进样，记录峰面积。以峰面积(A)为纵坐标，对照品浓度(C)为横坐标，进行线性回归，得回归方程：A=64 519C-250 835，r=0.999 7。结果表明伏立诺他在20.16～302.40 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.4 精密度实验 精密量取同一份伏立诺他对照品溶液20 μL，连续进样6次，测定峰面积，RSD为0.62%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性实验 取同一份供试品溶液，分别在0，2，4，8，20，24 h进样，测定峰面积，RSD值为0.74%，表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.6 重复性实验 对同一批样品平行取样6份，制备供试品溶液，测定伏立诺他的含量，平均为99.1%，RSD为0.52%，表明重复性良好。

2.7 加样回收率实验 分别取3，4，5 mL伏立诺他对照品溶液加入5 mL已知浓度的样品溶液中，摇匀，测定其含量，计算回收率，分别为103.5%，102.9%，100.2%(n=3)，RSD为1.72%。

2.8 定量限及检测限测定 取浓度为20.16 μg·mL-1的伏立诺他对照品溶液，用乙腈-水(30：70)逐级稀释，每次取20 μL进样测定，检测限信噪比按3：1计算，定量限按信噪比10：1计算，测得伏立诺他的定量限为33.60 ng·mL-1，检测限为10.08 ng·mL-1。

2.9 含量测定 取伏立诺他样品3批，按“2.2”项方法制备供试品溶液，取20 μL注入高效液相色谱仪。用标准曲线计算其含量，结果3批伏立诺他样品含量分别为99.2%，99.1%，99.0%。

2.10 有关物质的检查 取伏立诺他样品50.0 mg，置50 mL量瓶中，用乙腈-水(40：60)溶解，超声20 min，稀释至刻度，摇匀，作为有关物质检查的供试品溶液；精密量取供试品溶液1 mL置100 mL量瓶中，用乙腈-水(40：60)稀释至刻度，摇匀，作为有关物质检查的对照溶液。取20 μL该对照溶液进样，调节检测灵敏度，使主成分峰的峰高为满量程的20%～25%。分别取按上述方法配制的对照溶液和供试品溶液各20 μL进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的10倍。若供试品溶液色谱图中有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积，即要求有关物质的量小于1.0%。3批伏立诺他样品有关物质测定结果分别为0.50%，0.52%，0.49%(n=2)。

2.11 影响因素实验

2.11.1 高温实验 将伏立诺他供试品置药物稳定性检查仪中，在60 ℃条件下放置10 d，在第5天和第10天取样[5]，检测其含量以及有关物质。结果见表1。

2.11.2 高湿实验 将伏立诺他供试品置干燥器中，在25 ℃、相对湿度(90±5)%条件下放置10 d，在第5天和第10天取样检测[5]。恒湿条件采用在干燥器中放置硝酸钾饱和溶液来实现。在实验开始时称定质量为0.438 6 g，结束时为0.447 0 g，故吸湿增重<5%，则不需要在25 ℃、相对湿度(75±5)%下同法进行实验。见表1。

2.11.3 光照实验 将伏立诺他供试品置药物稳定性检查仪中，在照度为(4 500±500) Lx，温度为25 ℃条件下放置10 d，分别在第5天和第10天取样检测[5]。见表1。

3 讨论

3.1 检测波长的考察 取伏立诺他对照品溶液，在紫外分光光度计上于200～400 nm波长范围内扫描，结果伏立诺他在204和242 nm处有最大吸收峰，由于204 nm是低波长，易受干扰，故选择242 nm为伏立诺他的检测波长。将苯胺、辛二酸、7-苯胺基甲酰基庚酸甲酯、辛二酸单酰苯胺分别进行紫外波长扫描，结果辛二酸在210 nm处有最大吸收峰，其余均在242 nm处有最大吸收峰，故选择242 nm作为有关物质检测的波长。

表1 影响因素实验结果 %，n=2

3.2 流动相的考察 参考文献[6-8]，比较含量测定时流动相中乙腈与0.1%磷酸溶液的比例，分别为40：60，30：70，20：80。当乙腈与0.1%磷酸溶液的比例为30：70时，伏立诺他与其杂质峰能完全分离，拖尾因子最小，理论板数最大。因此含量测定所选用的流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(30：70)。辛二酸的检测波长为210 nm，在含量测定的条件下，按3倍信噪比计算其最低检测限为0.543 μg·mL-1，保留时间为5.052 min，与伏立诺他能较好的分离。以乙腈-0.1%磷酸溶液(30：70)为流动相，按外标法测定3批伏立诺他中辛二酸的含量。结果显示，3批均未检出辛二酸。故辛二酸不作为有关物质检查的内容。分别配制苯胺、7-苯胺基甲酰基庚酸甲酯、辛二酸单酰苯胺与伏立诺他对照品溶液及这4种溶液的混合溶液。以不同比例的乙腈-0.1%磷酸溶液(用三乙胺调节pH至3.0)为流动相，将混合溶液进样，当乙腈-0.1%磷酸溶液的比例为40：60时，各色谱峰能达到较好的分离，故有关物质检查采用乙腈-0.1%磷酸溶液(40：60)为流动相。

依据2010年版《中国人民共和国药典》二部附录ⅩⅨC“药物稳定性实验指导原则”对伏立诺他进行了影响因素实验，结果伏立诺他含量及有关物质均无明显变化。故伏立诺他在高温、高湿、光照条件下稳定。

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[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录199.

[6] 邹巧根，胡紫艳，韦萍.反相高效液相色谱法测定伏立诺他含量和有关物质[J].中国新药杂志，2011，20(24)：2467-2470.

[7] 顾群，李志刚，孙学伟.伏立诺他及其药物组合物中的杂质的高效液相色谱分析方法.中国：CN103018347A[P].2013-04-03.

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.026

2014-05-19

2014-11-04

詹长娟(1974-)，女，江苏扬州人，讲师，硕士，研究方向：药物分析。电话：0523-86150675，E-mail：jenny_yz@sina.com。

R979.1；R927.1

B

1004-0781(2015)08-1084-03