参菊洗剂体外抑菌作用*

张广求，刘文，谭璐，张为，王树平

(湖北省黄冈市中心医院药剂科，黄冈 438000)

参菊洗剂体外抑菌作用*

张广求，刘文，谭璐，张为，王树平

(湖北省黄冈市中心医院药剂科，黄冈 438000)

目的 研究参菊洗剂的体外抑菌作用。方法 采用琼脂扩散纸片法测定抑菌圈直径，采用液体培养液连续稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)，采用琼脂培养液平板法测定最低杀菌浓度(MBC)，并与市售某妇科洗液比较抑菌作用。结果 参菊洗剂对5种病原菌株的抑菌作用明显优于相同浓度的市售某妇科洗液，差异有统计学意义(P<0.05)；参菊洗剂对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌的MIC分别为33.75，67.50，67.50，67.50，33.75 mg·mL-1；参菊洗剂对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌的MBC分别为33.75，67.50，67.50，135.00，33.75 mg·mL-1。结论 参菊洗剂具有较明显的抑菌和杀菌作用。

参菊洗剂；琼脂扩散纸片法；液体培养液连续稀释法；琼脂培养液平板法；抑菌作用，体外

参菊洗剂是我院根据临床验方研制的中药制剂，主要由苦参、野菊花、黄柏、蛇床子等中药组成。具有消炎、止痒、除秽、杀菌功效，用于细菌性、真菌性、滴虫性阴道炎的治疗，具有较好的临床疗效。为了进一步证实其抗菌、消炎作用，笔者参考有关文献[1-3]，采用琼脂扩散纸片法、液体培养液连续稀释法和琼脂培养液平板法对参菊洗剂的体外抗菌活性进行了实验研究，为临床应用提供科学依据，现报道如下。

1 实验材料

1.1 仪器 YC-875S医用净化工作台(苏州净化设备厂)；SZK202净化工作台(蚌埠净化设备厂)；HHB11420电热恒温培养箱(湖北省黄石市医疗器械厂)；DG-1多功能恒温箱(上海医疗器械修理厂)；高压蒸汽灭菌器(上海三申医疗器械有限公司)；(0～150) mm×0.02 mm游标卡尺(上海九量五金工具有限公司)；KWY-100型电热干燥箱(武汉市武昌实验仪器厂)；打孔器(ф6 mm)。

1.2 培养液 水解酪蛋白琼脂培养液(M-H琼脂培养液)(批号：20130818)、水解酪蛋白肉汤培养液(M-H肉汤培养液)(批号：20130808)、改良马丁琼脂培养液(批号：20131117)、改良马丁培养液(批号：20140118)均由北京奥博星生物技术有限责任公司生产；蛋白胨(批号：20130430)、营养琼脂培养液(批号：20130314)、营养肉汤培养液(批号：20131210)均由北京双旋微生物培养液制品厂生产；0.9%无菌氯化钠溶液(上海化学试剂厂，AR，批号：130622)。

1.3 菌株 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白念珠菌[CMCC(F)98001]均为第0代冷冻保藏菌株，购自湖北省食品药品监督检验研究院。

1.4 稀释液及样品 0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(均按《中华人民共和国药典》方法[4]配制)；市售某妇科洗液(含生药量为1 g·mL-1)；参菊洗剂(含生药量为0.54 g·mL-1，黄冈市中心医院自制，批准文号：鄂药制字Z20110230，规格：每瓶250 mL，批号：130804，131221，140318)。

2 方法与结果

2.1 0.5麦氏比浊管的制备 采用比浊法控制菌液的浓度[5]。量取1.175%氯化钡(BaCl2·H2O)溶液0.5 mL，置100 mL量瓶中，加1%硫酸至刻度，充分摇匀，分装于试管中，每管5 mL，其浊度相当于菌液浓度为1.5×108CFU·mL-1[6]，置室温、暗处保存，用前摇匀。

2.2 菌液的制备 按无菌操作法，将菌株金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌解冻后，转种至M-H琼脂培养液斜面上，经35 ℃培养18～24 h，使菌株复壮和纯化；再用接种环挑起复壮并纯化的菌株适量于5 mL的M-H肉汤培养液中，35 ℃培养16～18 h[4]。将菌株白念珠菌解冻后，转种至改良马丁琼脂培养液斜面上，经25 ℃培养24～48 h，使菌株复壮和纯化；再用接种环挑起复壮并纯化的菌株适量于5 mL的改良马丁培养液中，25 ℃培养24 h。取上述培养物，分别置15 mm×175 mm的灭菌试管中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液5 mL，摇匀，以黑衬纸为背景，调节浊度至0.5麦氏比浊标准，使菌液浓度为1.5×108CFU·mL-1，备用。

2.3 药敏纸片的制备 选用吸水力强且质地均匀的滤纸，用打孔器制成直径6 mm的圆纸片，分装于西林瓶中，其中，每瓶30片×12瓶，每瓶90片×5瓶，用棉塞和牛皮纸封口，115 ℃热压灭菌30 min后，60 ℃干燥。取参菊洗剂3批或市售某妇科洗液，以无菌操作用无菌0.9%氯化钠溶液，分别稀释成含生药400，200，100 mg·mL-1的溶液。取滤纸片，分别浸泡上述参菊洗剂3批或市售某妇科洗液原液及其含生药400，200，100 mg·mL-1的溶液30 min。参菊洗剂每一批、每一浓度组30片，12瓶共360片；市售某妇科洗液每一浓度组90片，4瓶共360片。另取滤纸片1瓶90片，浸泡于无菌0.9%氯化钠溶液30 min，作为阴性对照。置60 ℃温箱干燥后，备用。

2.4 琼脂扩散纸片法药敏实验 按无菌操作法，分别取已融化并冷却至约50 ℃的M-H琼脂培养液或改良马丁琼脂培养液，倾入内径为9 cm的无菌平皿中，每平皿25 mL，使琼脂培养液平板厚度为4 mm，冷却至凝固。用无菌棉拭子蘸取“2.2”项下制备的菌液，在试管内壁液面上方挤去多余的菌液，从3个不同方向均匀涂布于上述琼脂培养液平板表面。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌菌液各涂布于M-H琼脂培养液平板27个，共108个，白念珠菌菌液涂布于改良马丁琼脂培养液平板27个。并将各实验菌均分为5组，即参菊洗剂或市售某妇科洗液原液组及含生药200，100，50 mg·mL-1的溶液组、无菌0.9%氯化钠溶液组。用无菌小镊子夹取“2.3”项下制备的药敏纸片，按顺时针方向，每平板等距均匀贴6片，各纸片中心距离相距>25 mm，同时纸片距平板内缘>15 mm，盖上平皿盖。倒置，M-H琼脂培养液平板置35 ℃培养24 h，改良马丁琼脂培养液平板置25 ℃培养48 h。取出平板，在透射光上用游标卡尺量取各纸片的抑菌圈直径，包括完全抑菌带和迟生长带的直径，抑菌圈边缘以肉眼不可见细菌或真菌明显生长为限。结果显示，不同浓度的参菊洗剂在体外对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和白念珠菌等5种菌株的抑菌圈直径，与相同浓度的市售某妇科洗液比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与无菌0.9%氯化钠溶液组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，提示参菊洗剂具有较好的体外抑菌作用。见表1。

2.5 最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)的测定 采用液体培养液连续稀释法，以市售某妇科洗液作为阳性对照药。按无菌操作法，取13 mm×100 mm的灭菌带棉塞的试管11支，编号，排列在试管架上。于每管中先加入M-H肉汤培养液(白念珠菌用改良马丁培养液)2.0 mL。于第1管中加入参菊洗剂或市售某妇科洗液原液2.0 mL，混匀后吸取2.0 mL加入第2管中，混匀后再吸取2.0 mL加入第3管中，如此连续倍比稀释至第9管，混匀后自第9管吸取2.0 mL弃去，使成1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256，1/512的各种药液浓度。此时，各管参菊洗剂浓度依次为270.00，135.00，67.50，33.75，16.88，8.44，4.22，2.11，1.06 mg·mL-1，市售某妇科洗液浓度依次为500.00，250.00，125.00，62.50，31.25，15.62，7.81，3.91，1.95 mg·mL-1。第10管不加受试药液作为阳性对照，以便观察培养液是否适合细菌或真菌生长；第11管加受试药液2.0 mL，混匀后吸取2.0 mL弃去，不加菌液，作为阴性对照，以便观察受试药液是否被污染。分别取“2.2”项下制备的细菌或真菌菌液50 μL，依次加入到上述第1～10管中。充分混匀后，置35或25 ℃培养24 h，观察有无细菌或真菌生长，如无法判断，则将可疑管接种到相应琼脂培养液上，置35或25 ℃培养24 h，以受试药液最低浓度管中无细菌或真菌生长者，为该试验菌的最低抑菌浓度。每菌株2管，平行操作3次，以2或3次相同结果为准。结果显示，参菊洗剂对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白念珠菌均有抑菌活性，其中，对金黄色葡萄球菌和白念珠菌的MIC均为33.75 mg·mL-1，对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌的MIC均为67.50 mg·mL-1。市售某妇科洗液对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的MIC均为125 mg·mL-1，对枯草芽孢杆菌的MIC为250 mg·mL-1，对白念珠菌的MIC为62.50 mg·mL-1。提示参菊洗剂对上述5种致病菌均有较强的抑制作用，且效果优于市售某妇科洗液。见表2，3。

2.6 最低杀菌浓度(minimum bactericidal concen-tration，MBC)的测定 从MIC测定中未生长细菌或真菌的试管，分别吸取0.1 mL接种于M-H琼脂培养液或改良马丁琼脂培养液平皿上，置35或25 ℃培养24～48 h，观察结果，以无菌生长的最小稀释度的药物浓度，为该药的最低杀菌浓度。每菌株2管，平行操作3次，以2或3次相同结果为准。结果，参菊洗剂对金黄色葡萄球菌、白念珠菌的MBC均为33.75 mg·mL-1，对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的MBC均为67.50 mg·mL-1，对枯草芽孢杆菌的MBC为135.00 mg·mL-1。

表1 不同浓度参菊洗剂和市售某妇科洗液对5种病原菌株的抑菌圈直径

表2 不同浓度参菊洗剂对5种病原菌株的MIC

“-”表示无细菌或真菌生长；“+”表示有细菌或真菌生长

“-”means no bacterial or fungal growth；“+”means bacterial or fungal growth

表3 不同浓度市售某妇科洗液对5种病原菌株的MIC

“-”表示无细菌或真菌生长；“+”表示有细菌或真菌生长

“-”means no bacterial or fungal growth；“+”means bacterial or fungal growth

3 讨论

文献[7-10]对临床感染病原菌的分布进行分析，结果表明病原菌感染位居前几位的依次是大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷白杆菌、金黄色葡萄球菌、白色假丝酵母菌(即白念珠菌)。苦参有抗滴虫作用，对痢疾埃希菌、大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用；黄柏有杀灭阴道滴虫作用，对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和多种致病性皮肤真菌均有抑制作用；蛇床子有抗滴虫作用，对絮状表皮癣菌、石膏样小芽胞菌、羊毛状小芽胞菌有抑制作用[11]。研究结果显示，一定浓度的参菊洗剂对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和白念珠菌等阴道常见致病菌均有较强的抑制和杀灭作用，并呈剂量-效应关系，且效果优于市售某妇科洗液。参菊洗剂处方组成除含有市售某妇科洗液中的苦参、黄柏、蛇床子外，尚含野菊花、鱼腥草、千里光、雄黄、寻骨风等药材。野菊花对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠埃希菌及多种致病性杆菌、皮肤真菌均有一定抗菌作用[11]，鱼腥草、千里光、雄黄、寻骨风对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及真菌等多种微生物均有抑制作用[12]。

琼脂扩散纸片法能定性测定药物的体外抑菌活性，可用于体外抑菌试验的初筛。采用液态培养液连续稀释法，药液与菌液充分混合，能客观反映药物的抑菌效果，可定量测定药物抑制微生物生长的能力。

菌液的浓度对抑菌圈的影响较大，菌液浓度越高，抑菌圈越小。若菌液浓度过高，会出现该菌对所有浓度的药物耐药的结果；相反，菌液浓度过低，则会出现该菌对所有浓度的药物均敏感的结果。接种的菌液浓度应稀释至0.5麦氏比浊单位为宜，相当于1.5×108CFU·mL-1[12]。

本研究仅从体外抑菌试验方面，探讨了参菊洗剂对上述5种常见菌的药效作用，得出其体外抑菌效果明显的结论，对其他细菌如加德纳杆菌的抑菌作用以及体内抑菌效果，有待进一步探讨。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.011

Antibacterial Effect ofShenjuLotioninVitro

ZHANG Guangqiu,LIU Wen,TAN Lu, ZHANG Wei, WANG Shuping

(DepartmentofPharmacy，HuanggangCentralHospital，Huanggang438000,China)

Objective To study the antibacterial effect ofShenjulotioninvitro. Methods The diameter of inhibition zone was determined by paper-disc agar-diffusion method.Minimum inhibitory concentration (MIC) and Minimum bactericidal concentration (MBC) was determined by culture medium dilution methodand agar medium plate method, respectively.Antibacterial effect was compared betweenShenjulotion and city sale of the gynecological lotion. Results Inhibitory effects ofShenjulotion on 5 pathogenic strains were significantly better than that of city sale of the gynecological lotion at the same concentrations (P<0.05).MIC ofShenjulotion onStaphylococcusaureus,Pseudomonasaeruginosa,Escherichiacoli,BacillussubtilisandCandidaalbicanswas 33.75, 67.50, 67.50, 67.50 and 33.75 mg ·mL-1, respectively.MBC ofShenjulotion onStaphylococcusaureus,Pseudomonasaeruginosa,Escherichiacoli,BacillussubtilisandCandidaalbicanswas 33.75, 67.50, 67.50, 135.00 and 33.75 mg ·mL-1, respectively. ConclusionShenjulotion has obvious bacteriostasis and sterilization effect.

Shenjulotion；Paper-disc agar-diffusion method；Liquid culture medium dilution method；Agar medium plate method；Antibacterial effect,invitro

2014-07-28

2014-10-16

*湖北省黄冈市科技计划项目(黄科字[2013]76号)

张广求(1964-)，男，湖北黄梅人，副主任药师，研究方向：医院药学、药物分析。电话：0713-8625312，E-mail：ccnpa@163.com。

R286；R978

B

1004-0781(2015)08-1032-04