糖皮质激素受体α对预测多发性硬化患者激素反应性的价值

郝溥辰 张星虎

糖皮质激素受体α对预测多发性硬化患者激素反应性的价值

郝溥辰 张星虎

目的 探讨糖皮质激素受体α(glucocorticoid receptorα，GRα)对预测多发性硬化(multiple sclerosis，MS)患者激素反应性的价值。方法 使用ELISA法检测19例MS患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中平均GRα浓度；于治疗前、治疗后28 d对患者行扩展残疾状况评分量表(expanded disability status scale, EDSS)评分；测定7例患者的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration of a substance,IC50)并与19名健康对照进行比较。结果 治疗有效组MS患者平均GRα浓度显著高于治疗无效组〔(131.94±76.28)ng/106细胞vs. (56.98±25.28)ng/106细胞，P<0.05〕。MS患者治疗前平均GRα浓度与IC50间呈负相关(r=-0.826，P<0.05)。结论 GRα对MS患者的激素反应性存在一定预测价值，可能成为预测MS患者激素反应性的新指标。

多发性硬化；糖皮质激素受体；激素反应性；IC50；EDSS评分

多发性硬化(multiplesclerosis，MS)是一种以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫病。糖皮质激素(glucocorticoid,GC)是MS急性期的首选治疗药物[1]。糖皮质激素受体α(glucocorticoidreceptorα,GRα)通过调控GC使其发挥生理、药理功能。既往研究结果提示[2]GRα与MS患者的激素反应性之间存在密切联系。本研究通过ELISA法检测MS患者平均GRα浓度，评价其与神经功能评分和半抑制浓度(IC50)的关系，旨在建立一个预测MS患者激素反应性的新指标。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2012-01-2014-01首都医科大学附属北京天坛医院神经内科复发-缓解型MS住院患者19例，其中男8例，女11例。入组标准：(1)年龄18～60岁；(2)符合McDonald(2010年)诊断标准中确诊MS；(3)末次复发在1个月之内；(4)发作期扩展残疾状况评分量表(expandeddisabilitystatusscale,EDSS)评分较缓解期至少增加1分；(5)同意入组并签署知情同意书。排除标准：(1)入组前3个月内正在使用免疫抑制剂(硫唑嘌呤或环孢素等)或干扰素；(2)入组前1个月正在使用激素；(3)合并全身感染性疾病；(4)合并严重心、肝、肾疾病；(5)合并系统性自身免疫性疾病(如类风湿关节炎等)。对照组为年龄18～60岁的健康成年人，共19例，其中男10例，女9例。

1.2 方法

1.2.1 外周血单个核细胞(PBMC)GRα浓度测定：所有患者(于使用GC前、使用GC后7d)及对照者均在早晨7：00～9：00空腹抽取外周静脉血2mL，置于EDTA抗凝管。将2mL血液与2mLRPMI1640培养液均匀混合，用加样枪将混合液缓慢加于3mL淋巴细胞分离液之上，以400 g离心40min，吸取其中单个核细胞层，计数。用PBS将PBMC水平调至1×106细胞/mL。取1mLPBMC悬液置于Ep管内，使用超声震碎法裂解细胞。将裂解后的PBMC悬液于300 g离心10min，吸取上清液，使用ELISA试剂盒(武汉伊艾博公司)检测GRα浓度(ng/mL)，结合PBMC水平为1×106细胞/mL，可将平均GRα浓度单位换算为ng/106细胞。

1.2.2IC50检测：抽取患者(未用激素治疗前)和正常人外周静脉血3mL，置于EDTA抗凝管。于无菌操作台中，将全血加入24孔板中，每孔加入400μL，共6孔。并于6孔中再分别加入以下物质：第1孔加入100μLRPMI1640培养液；第2孔加入50μL脂多糖(30ng/mL)+50μLRPMI1640培养液；第3孔加入50μL脂多糖(30ng/mL)+50μL地塞米松(1×10-5mol/L)；第4孔加入50μL脂多糖(30ng/mL)+50μL地塞米松(1×10-6mol/L)；第5孔加入50μL脂多糖(30ng/mL)+50μL地塞米松(1×10-7mol/L)；第6孔加入50μL脂多糖(30ng/mL)+50μL地塞米松(1×10-8mol/L)。置于无菌培养箱中培养24h后，将样本转移至Ep管中，以600 g离心10min，吸取上清液，使用ELISA试剂盒(BenderMedSystems)检测白细胞介素-6(IL-6)浓度(ng/mL)。根据IL-6浓度与其对应的地塞米松终浓度，通过专门软件计算使IL-6浓度下降50%时的地塞米松浓度，即IC50。

1.2.3EDSS评分：在MS患者治疗前及治疗后28d进行EDSS评分，将EDSS评分下降至少1分定义为治疗有效，以此标准将MS患者分为治疗有效组和治疗无效组。

1.3 统计学处理 使用SPSS17.0统计分析软件进行分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，采用t检验；平均GRα浓度与EDSS评分和IC50的关系采用Pearson相关系数分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组平均GRα浓度比较MS患者治疗前平均GRα浓度低于对照组〔(96.42±68.36)ng/106细胞vs.(506.58±495.58)ng/106细胞，P<0.05〕；MS患者治疗后7d平均GRα浓度〔(539.06±620.78)ng/106细胞〕较治疗前增高(P=0.003)。MS患者IC50为(1.73×10-8±2.49×10-8)mol/L，对照组IC50为(5.37×10-10±4.48×10-10)mol/L，MS患者IC50高于对照组，但两者间比较差异无统计学意义(P=0.126)。

2.2MS患者治疗前后平均GRα浓度比较 19例患者中治疗有效组10例，治疗无效组9例。治疗有效组治疗前、后平均GRα浓度和平均GRα浓度变化值均高于治疗无效组(均P<0.05，表1)。

2.3 平均GRα浓度与EDSS评分和IC50的关系 19例MS患者治疗前平均GRα浓度与EDSS评分变化(治疗前后EDSS评分之差)无明显相关性(r=0.419，P=0.074)；7例进行IC50测定的MS患者，治疗前平均GRα浓度与IC50呈负相关(r=-0.826，P=0.022)。

3 讨论

GRα主要存在于细胞质中。当GC与GRα结合后，形成GR-GC同源二聚体复合物，诱导GR-GC二聚体进入细胞核，最终激活或抑制靶基因的表达，调节相关蛋白质合成。GRα表达量的下降是激素反应性降低的重要原因之一[3]。

本研究发现MS患者治疗前PBMC中平均GRα浓度明显低于健康对照组，这与Matysiak等研究结果一致[4]，表明反复应用GC后可导致GRα表达量下降，进而可能造成激素反应性下降。其可能的机制包括：(1)反复应用GC导致T细胞凋亡，造成T细胞平衡紊乱和功能下降，进而使GRα表达下降[5]；(2)GRα的信号传导通路中的多种辅助蛋白可能在GC作用下出现表达异常，造成GRα蛋白转录减少[6]；(3)GRα的亚型GRβ表达上升，通过直接或间接与GRα结合，减少GRα表达[7]；(4)MS患者存在数个与健康人明显不同的基因，这些基因本身和其转录而来的蛋白可能造成GRα表达量的改变[8]。治疗后GRα表达量增加考虑为机体正反馈所致。

表 1 不同疗效组间平均GRα浓度比较细胞)

注：与无效组比较，*P<0.05

本研究结果显示，治疗有效组治疗前、治疗后平均GRα浓度和平均GRα浓度变化显著高于治疗无效组，这与既往研究结果一致[10]，也与GRα的作用机制相符合，表明GRα表达量越高，患者临床症状改善越明显，对激素反应性越好，提示GRα可以反映MS患者激素疗效。

治疗前平均GRα浓度与治疗前后EDSS评分变化之间无明显线性关系，这与既往研究结果一致[10]，提示两者间可能不是简单的线性关系，也可能与EDSS评分不能充分反映患者症状改变有关。

本研究发现7例MS患者与健康对照组IC50间比较差异无统计学意义。这与DeRijk 等[11]研究结果不一致，考虑可能为本研究样本较少所致。

7例MS患者的治疗前平均GRα浓度与IC50呈负相关，提示治疗前平均GRα浓度越高，其IC50越小，激素体外敏感性越高，对激素的反应性越好。本研究结果提示平均GRα浓度在与IC50可能存在一致性，或许可以成为预测MS患者激素疗效的新指标，但由于样本数较少，故确切结论有待进一步验证。

综上所述，GRα对MS患者的激素反应性存在一定预测价值，可能成为预测MS患者激素反应性的新指标。

[1]Mcdonald W I, Compston A, Edan G, et al. Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the diagnosis of multiple sclerosis[J]. Ann Neurol,2001,50(1):121-127.

[2]楼之茵, 胡学强. 多发性硬化患者糖皮质激素受体和甲基强的松龙疗效的关系[J]. 中国神经免疫学和神经病学杂志,2007,14(2):61-64.

[3]Barnes PJ, Adcock IM. Glucocorticoid resistance in inflammatory diseases[J]. Lancet,2009,373(9678):1905-1917.

[4]Matysiak M, Makosa B, Walczak A, et al. Patients with multiple sclerosis resisted to glucocorticoid therapy: abnormal expression of heat-shock protein 90 in glucocorticoid receptor complex[J]. Mult Scler,2008,14(7):919-926.

[5]Sionov RV, Kfir S, Zafrir E, et al. Glucocorticoid-induced apoptosis revisited: a novel role for glucocorticoid receptor translocation to the mitochondria[J]. Cell Cycle,2006,5(10):1017-1026.

[6]Yang N, Ray DW, Matthews LC. Current concepts in glucocorticoid resistance[J]. Steroids,2012,77(11):1041-1049.

[7]Barnes PJ. Corticosteroid resistance in patients with asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J]. J Allergy Clin Immunol,2013,131(3):636-645.

[8]Ramanathan M, Weinstock-Guttman B, Nguyen LT, et al. In vivo gene expression revealed by cDNA arrays: the pattern in relapsing-remitting multiple sclerosis patients compared with normal subjects[J]. J Neuroimmunol,2001,116(2):213-219.

[9]Kurtzke JF. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an expanded disability status scale (EDSS)[J]. Neurology,1983,33(11):1444-1452.

[10]胡学强, 楼之茵, 周国钰. 多发性硬化患者糖皮质激素受体蛋白和mRNA表达与激素疗效的相关性[J]. 中华神经科杂志,2007,40(9):605-609.

[11]Derijk RH, Eskandari F, Sternberg EM. Corticosteroid resistance in a subpopulation of multiple sclerosis patients as measured by ex vivo dexamethasone inhibition of LPS induced IL-6 production[J]. J Neuroimmunol,2004,151(1-2):180-188.

(本文编辑：时秋宽)

The value of glucocorticoid receptorαin predicting steroid response in patients with multiple sclerosis

HAOPuchen,ZHANGXinghu*.

*Department of Neurology, Tiantan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China

ZHANGXinghu,Email:xhzhtiantan@hotmail.com

ObjectiveTostudythevalueofglucocorticoidreceptor(GRα)inpredictingsteroidresponseinpatientswithmultiplesclerosis(MS).MethodsGRαinperipheralbloodmononuclearcell(PBMC)of19MSpatientswasdetectedbyELISA.Expandeddisabilitystatusscale(EDSS)scorewasevaluatedbeforeand28daysaftertreatment.IC50of7MSpatientsandcontrolgroupweredetectedbeforetreatment.ResultsTheaverageconcentrationofGRαinMSpatientswhosetreatmentwaseffectivewashigherthantherestofMSpatients[(131.94±76.28)ng/106cellsvs. (56.98±25.28)ng/106cells，P<0.05].TheaverageconcentrationofGRαandIC50hadanegativecorrelation,thePearsoncorrelationcoefficientwas-0.826, P=0.022.ConclusionsDetectingtheaverageconcentrationofGRαmaybeanewmethodtopredictthesteroidresponseofMSpatients.

multiplesclerosis；glucocorticoidreceptor；steroidresponse；IC50；EDSSscore

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.01.003

教育部神经病学重点学科、国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2007AA02Z453)

100050 首都医科大学附属北京天坛医院神经内科

张星虎，Email：xhzhtiantan@hotmail.com

R744.5+2；R544.1

A

1006-2963 (2015)01-0009-03

2014-05-19)